La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Summary

Estudios biofísicos y bioquímicos de las interacciones entre los dominios de la proteína de membrana integrados se enfrentan a muchos desafíos técnicos, la primera de las cuales es la de conseguir material de estudio adecuado. En este artículo se describe un protocolo para producir y purificar estabilizadas por puentes disulfuro complejos de péptidos transmembrana que son adecuados para el análisis estructural por la solución de resonancia magnética nuclear (RMN) y otras aplicaciones analíticas.

Abstract

Interacciones físicas entre las incrustados lípido-alfa-helicoidales dominios de proteínas de membrana juegan un papel crucial en el plegamiento y ensamblaje de los complejos de proteínas de membrana y en procesos dinámicos tales como transmembrana (TM) de señalización y regulación de los niveles de proteína de la superficie celular. Descripción de las características estructurales que impulsan la asociación de secuencias particulares requiere sofisticados análisis biofísicos y bioquímicos de los complejos de péptido de TM. Sin embargo, la hidrofobia extrema de dominios TM hace que sean muy difíciles de manipular utilizando técnicas estándar de la química de péptidos, y la producción de material de estudio adecuado a menudo resulta prohibitivamente difícil. La identificación de condiciones bajo las cuales los péptidos pueden adoptar conformaciones helicoidales estables y complejos se forman espontáneamente añade un nivel más de dificultad. Aquí presentamos un procedimiento para la producción de homo-o hetero-dímeros complejos de péptido de TM a partir de materiales que se expresan en E. columnai, permitiendo así la incorporación de etiquetas de isótopos estables para resonancia magnética nuclear (RMN) o no naturales de aminoácidos para otras aplicaciones relativamente económica. La innovación clave de este método es que los complejos de TM son producidos y purificados como covalentemente asociados (disulfuro de reticulado) ensamblados que pueden formar estructuras estables, estequiométrica y homogénea, cuando se reconstituye en detergente, lípidos u otros materiales miméticos de membrana. También presentamos los procedimientos cuidadosamente optimizados para la expresión y purificación que son igualmente aplicables ya sea para producir un solo TM dominios o complejos entrecruzados y proporcionar asesoramiento para adaptar estos métodos a las nuevas secuencias de TM.

Introduction

Este protocolo detalla un procedimiento que hemos desarrollado para producir complejos estabilizados con disulfuro de péptidos transmembrana (TM) para los estudios estructurales mediante RMN solución. El procedimiento tiene la ventaja de la expresión robusta que ofrece el sistema de fusión ΔtrpLE1413 (ver más abajo) y permite que los complejos de péptidos de TM composición definida para ser generados usando sofisticadas técnicas de isótopos estables de etiquetado para los modernos experimentos de RMN multidimensionales. Hemos empleado estas técnicas para determinar varias estructuras de RMN que revelaron nueva información importante sobre cómo linfocitos activadores de immunoreceptors se ensambla a partir de múltiples subunidades de proteínas de membrana a través de interacciones entre sus dominios TM (recientemente revisado en ^1). Estas técnicas son aplicables a muchos otros sistemas de proteínas de membrana, así como una amplia gama de métodos de análisis aguas abajo, además de RMN solución. Mientras que el ejemplo dado aquí utiliza residuos de cisteína nativospara crear un complejo que imita la forma natural unido por puentes disulfuro de proteínas, el diseño es igualmente adecuado para la creación de enlaces disulfuro de ingeniería para estabilizar complejos que normalmente se mantienen juntas por más débiles, interacciones no covalentes, tales como homo-y hetero-dímeros de complejos TM receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR)-proteínas de la familia ^2-4 o αβ heterodimeric complejos integrina ^5,6.

Extremadamente hidrófobos secuencias de péptidos tales como los derivados de la bicapa lipídica que abarca porciones de proteínas TM son sujetos excesivamente difícil para los estudios bioquímicos y biofísicos. Además de ser muy difícil de manipular usando proteína estándar y técnicas de química de péptidos, a menudo son muy tóxicos para las células y son por lo tanto difíciles de producir recombinantemente. Nosotros y otros ^{7,8 9-11} han tenido un éxito significativo expresar esas secuencias de péptidos difíciles en bacterias como en marco carboxi-terminalfusiones con una versión modificada de la secuencia ΔtrpLE1413 derivado de la E. coli trp operón ^12. El polipéptido de ~ 13 kDa trpLE codificada por esta secuencia se puede producir en niveles elevados en virtud de un promotor T7 y está totalmente localizada en los cuerpos de inclusión donde los problemas relacionados con la toxicidad y / o la inestabilidad son eludidas. Modificación de la secuencia de la adición de un amino-terminal 9-histidina ¹³ y la eliminación de los residuos internos de metionina y cisteína de la secuencia trpLE ¹⁴ permitidos trpLE-péptido fusiones de ser purificada por metal-ion cromatografía de afinidad y digerido usando bromuro de cianógeno (CNBr ) para liberar la secuencia peptídica deseada. Hemos utilizado con éxito este sistema para expresar más de una docena de diferentes secuencias como fusiones TrpLE que representan fragmentos de proteínas de membrana que contienen hasta cuatro dominios TM ^(7,8 y resultados no publicados, véase también el apartado de discusión).

Lainnovación clave en este protocolo es la identificación de las condiciones en las que los no estructurados y muy poco soluble en trpLE-TM fusiones pueden ser eficientemente disulfuro de reticulado en el contexto de un flujo de trabajo optimizado. Varios aspectos de alto rendimiento de expresión, la manipulación y la purificación de los productos peptídicos también se han optimizado a fondo, y las recomendaciones que aquí se presentan son igualmente relevantes para la producción de no reticulados disulfuro productos (monomérica) TM peptídicos.

Protocol

1. Clonación y Diseño Construct

Clonar las secuencias de interés en el vector de PMM-péptido (que se puede proporcionar a petición) usando HindIII y sitios de restricción BamHI (véase la Figura 1). El inserto de ADN de doble hebra deben incorporar, en el orden siguiente: un sitio HindIII; un solo codón metionina para la escisión con CNBr, la E. coli codón optimizado péptido secuencia de codificación, un codón de parada, un sitio BamHI. Todas las metioninas otros en el péptido debe ser eliminada y la secuencia de dipéptido asp-pro se debe evitar ya que también se puede escindir en condiciones ácidas.

Un único residuo de cisteína debe ser introducido en cada secuencia de péptido de acuerdo con el posicionamiento deseado de la reticulación de disulfuro en el complejo final, y todas las otras cisteínas debe ser mutado a serina. El plásmido lleva un casete de resistencia a kanamicina para la selección.

2. Expresión de trpLE-Peptide Fusión

1. Maquillaje y filtro estéril medio M9/Kan mínimo crecimiento (0,1 mM CaCl _2, 2 mM MgSO _4, 3 g / L KH ₂ PO _4, 7,5 g / l de Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 0,5 g / L NaCl, 1 g / l NH ₄ Cl, 4 g / L de glucosa, 50 mg / L de sulfato de kanamicina). Suplemento con Centrum completa de A a zinc para proporcionar vitaminas B y metales traza:. Disolver 1 comprimido en 40 ml de H ₂ O con mezcla durante 30 min, centrifugar para eliminar el material insoluble y el sobrenadante estéril filtro naranja Tienda solución madre a 4 ° C en la oscuridad durante hasta 2 semanas y el uso de 4 ml / L en M9.
   NOTA: ¹⁵ N enriquecido con NH ₄ Cl, ^C-13 glucosa enriquecido u otros precursores de isótopos estables marcados pueden ser incluidos en medio M9 que en esta etapa si se desea.
2. Inocular un cultivo de 100 ml de arranque recién transformado BL21 E. (DE3) cepa coli en medio M9/Kan. Crecer durante la noche a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
3. A la mañana siguiente, comprobar la OD ₆₀₀ del cultivo iniciador - esto debe estar en el intervalo de 2 o mayor. Diluir el cultivo de 100 ml de arranque en 1 l de volumen total de Centrum medio suplementado M9. Dividido en dos matraces de 2 L deflectores (500 ml de cultivo en cada matraz) y crecen a 37 ° C con agitación a 140 rpm hasta que la DO ₆₀₀ alcanza 0,6.
4. Ajuste la temperatura del agitador a 18 ° C y continuar agitando durante 1 hora, permitiendo que las culturas se enfríe por completo antes de la inducción.
5. Tomar una muestra de pre-inducción para el análisis de SDS-PAGE (equivalente de 50 l de un cultivo a una DO de ₆₀₀ = 1), a continuación, añadir IPTG a una concentración final de 0,1 mM para inducir la expresión de la fusión trpLE-péptido. Continuar creciendo a 18 º C/140 rpm durante la noche (16-20 horas) en la inducción de IPTG.

3. Inclusión Preparación Corporal y Encuadernación matriz de níquel

1. La final OD ₆₀₀ de cultivos de expresión durante la noche en medio mínimo es variable y should ser de entre 2,5 y 5,0. Tomar una muestra para análisis SDS-PAGE (equivalente de 50 l de un cultivo a una DO de ₆₀₀ = 1) y recoger las células por centrifugación durante 20 min a 5.000 x g.
2. Resuspender el sedimento de células de cultivo L 1 en 50 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM β-ME, 0,2 M NaCl). Las suspensiones celulares se puede almacenar congelado para su posterior procesamiento.
3. Lisar las células por sonicación en hielo a potencia máxima durante 1 min y el resto en hielo durante 5 min. Usamos un Sonicator Misonix 3000 (max 600 vatios de salida) con una punta de ½ pulgadas de alta intensidad reemplazable. Repita sonicación / refrigeración durante tres ciclos.
4. Recoger el cuerpo de inclusión insoluble (IB) el material por centrifugación durante 15 min a 20.000 xg y descartar el sobrenadante. Una capa suelta y fina de restos de células de color más claro puede ser visible en la parte superior de la densa pellet IB; este puede ser lavado con agua o tampón con agitación suave. Pasos 3,3 y 3,4 se puede repetir para mejorar la pureza de la fracción IB si desirojo. Las muestras de sedimento y el material sobrenadante se deben tomar para el análisis de SDS-PAGE para confirmar trpLE-TM localización fusión a los cuerpos de inclusión.
5. Disolver IB pellets en solución de guanidina (6 M de guanidina HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% de Triton X-100, 5 mM β-ME), con 25-50 ml por litro de cultivo procesado. Este paso requiere varias horas con agitación y sonicación suave ocasional.
6. Borrar el lisado IB por centrifugación durante 1 hora a 75,000-100,000 xg y 20 ° C. Decantar el sobrenadante y filtrar a través de una membrana de 0,2 micras.
7. Combinar el lisado aclarado IB, en un tubo cónico de 50 ml o un recipiente más grande que se puede cerrar de forma segura, con resina de afinidad de níquel que ha sido lavada con agua y se equilibra con solución de guanidina. Usar 3-4 ml de resina se establecieron por litro de cultivo procesado para las fusiones que expresan a un grado similar como trpLE-DAP12TM se muestra aquí (Figura 3, carril 2). Lotes se unen mediante la incubación de la noche a la habitación t emperatura con mezcla suave.

4. En la columna de reticulación oxidativa

1. Cargue el lisado IB / níquel suspensión de resina en una columna de desagüe vacío con soporte de lecho poroso, agregando continuamente hasta que todo el volumen fluye. Recoger y dejar a un lado la medición de flujo, que pueden contener proteína no unida fusión.
2. Lavar la resina de níquel mediante flujo por gravedad con 5 volúmenes de lecho de solución de urea (8 M urea, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) que contienen 5 mM β-ME.
3. Lavar la resina de níquel de nuevo con 5 volúmenes de lecho de solución de urea sin β-ME.
4. Lavar la resina de níquel una tercera vez con 5 volúmenes de lecho de solución de urea que se ha complementado con 20 mM CuSO ₄ y 2 mM de glutatión oxidado. Después de este lavado, cerrar la salida de la columna y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación máxima de enlace disulfuro.

5. TFA Elución y Cuantificación

contenido "> PRECAUCIÓN: ácido trifluoroacético (TFA) provoca graves quemaduras al entrar en contacto con la piel y los vapores son muy irritantes TFA concentrado debe utilizarse sólo en una campana de humos químicos aprobados con protección para los ojos y guantes que no contengan látex Compruebe la compatibilidad química de todos.. los materiales utilizados, el polipropileno es compatible con todos los pasos de este protocolo.

1. Lavar la solución de urea oxidante con 10 volúmenes de lecho de agua y secar el lecho de la columna mediante la aplicación de una línea de vacío a la salida de la columna.
2. Cierre la salida de la columna y añadir 1,5 volúmenes de lecho de puro (99-100%) TFA. Se agita la resina de níquel con una pequeña espátula de garantizar una exposición al ácido y se incuba durante 5 min. Abrir la salida de la columna y recoger el eluato ácido, presurizando suavemente con una jeringa o una línea de aire comprimido, si es necesario para expulsar todo el líquido.
3. Repita el paso de elución ácida con otros 1,5 volúmenes de lecho de TFA puro. Trabajar rápidamente en este paso para evitar la disolución completa de la beaded matriz de agarosa. El rendimiento de proteína se puede determinar en este punto según la ecuación de Beer-Lambert y el coeficiente de extinción molar teórico de la secuencia trpLE-péptido. Se diluye una muestra del eluato TFA (1:20 a 1:50) en trifluoroetanol (TFE) y medir la absorbancia a 280 nm, utilizando TFA / TFE a la misma dilución como blanco.

6. La digestión con CNBr

ADVERTENCIA: El bromuro de cianógeno (CNBr) es extremadamente tóxico y debe ser manejado sólo en una campana de humos químicos aprobado. PPE incluyendo gafas de seguridad, bata de laboratorio y guantes de látex no son absolutamente necesarios. CNBr es reactivo a la humedad y debe estar a temperatura ambiente antes de abrirse. Póngase en contacto con su oficina de seguridad institucional para obtener instrucciones sobre la neutralización / enajenación de CNBr contaminados con soluciones y materiales.

1. Diluir el eluido ácido a la concentración de TFA 80% final de la adición gota a gota de agua mientras se mezcla suavemente. Si se forma un precipitado, unadd atrás un pequeño volumen (0,5 a 1 ml) de TFA puro hasta que se clarifique la solución, a continuación, re-correcta a 80% con agua. Tomar un 5 l pre-digestión de la muestra para el análisis de SDS-PAGE, la congelación en nitrógeno líquido y liofilizar la muestra inmediatamente.
2. Añadir cristales CNBr a aproximadamente 0,2 g / ml, teniendo cuidado para pesar el producto químico tóxico de forma segura en cerradas, tubos previamente pesados ​​o usando un equilibrio dentro de la campana química. Mezclar suavemente hasta su completa disolución. Enjuague y sellar el recipiente de reacción en atmósfera de gas inerte (nitrógeno o argón corriente) e incubar 3-4 horas a temperatura ambiente, protegido de la luz.
3. Tomar un 5 l post-digestión de la muestra para el análisis por SDS-PAGE y congelar y liofilizar inmediatamente. Transferir la reacción de digestión a un casete de diálisis de celulosa regenerada o tubería (acetato de celulosa se ​​disuelve en ácido concentrado) con un corte de peso molecular de 3,5 kDa o menos, de acuerdo con el tamaño del complejo péptido esperado. Dializar durante toda la noche a 4 L de agua en lacampana química para reducir la concentración de TFA y descomponer cualquier CNBr sin reaccionar. Deje espacio en el casete de diálisis o las tuberías para un aumento significativo en el volumen (tanto como de dos a tres veces) durante la diálisis durante la noche.
4. Quitar la solución de reacción dializada con precipitado suspendido de la casete de diálisis o los tubos (la mayor parte de la proteína se precipita cuando la concentración de TFA se reduce) y transferir la suspensión a tubos de 50 ml cónicos. Congelar y liofilizar para eliminar el agua y trazas de CNBr / TFA. Este paso es probable que requieren varios días.
   PRECAUCIÓN: Tanto la reacción dializada resumen y el agua de diálisis deben seguir siendo tratados como tóxicos y manipulados / desecharse con las precauciones adecuadas.
5. Muestras de cultivos procedentes de las etapas de pre-inducción y la cosecha, por cuerpos de inclusión sobrenadante y el sedimento, el eluido TFA y digerido con CNBr material puede ser analizado mediante SDS-PAGE. Preparar muestras por calentamiento a 95 ° C en Invitrogen NuPAGE LDS sample tampón. Eluato TFA y muestras de digerir deben estar preparados tanto en condiciones reductoras y no reductoras para facilitar la identificación del producto y la evaluación de la reticulación oxidativa.
6. Separar las muestras en un 12% NuPAGE bis-tris gel de acrilamida prefabricado utilizando MES-SDS funcionamiento de amortiguación para una resolución óptima de los productos más pequeños digerir.

7. HPLC de fase inversa Purificación de disulfuro reticulados complejos de péptidos

1. Disolver hasta 100 mg de liofilizado productos resumidos en 2-3 ml de ácido fórmico puro y carga en un a escala preparativa (21,2 x 150 mm) de Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT columna de disolvente A (típicamente acetonitrilo 10-20% o 5 -10% de isopropanol en agua con 0,1% de TFA).
2. La elución de los productos de digestión en un gradiente de disolvente B (acetonitrilo o isopropanol con 0,1% TFA) durante al menos 5 volúmenes de columna. Véase la discusión para obtener sugerencias sobre la selección de las condiciones óptimas para el gradiente de secuencias de péptidos diferentes.
3. Tomar50-100 muestras mu l de cada fracción de HPLC para el análisis de SDS-PAGE y congelar y liofilizar inmediatamente. Eliminación de los disolventes de HPLC es rápido y debe ser completa en 1-2 horas.
4. Preparar muestras liofilizadas de HPLC para SDS-PAGE por calentamiento a 95 ° C en tampón de muestra de Invitrogen NuPAGE LDS sin agente reductor. Enfriar y se dividió cada muestra uniformemente en 2 tubos de microcentrífuga, añadiendo DTT 100 mM a una de ellas y brevemente re-calentamiento.
5. Se separan las muestras de HPLC reducidas y no reducidas en un 12% NuPAGE Bis-Tris gel de acrilamida premoldeados con MES-SDS funcionamiento de amortiguación como anteriormente. Pequeños péptidos hidrofóbicos, a menudo no toman Coomassie bien y no se puede ejecutar en sus pesos moleculares esperados. Sin embargo, la comparación de muestras reducidas y no reducidas debe facilitar la identificación de los productos peptídicos reticulados y de evaluación de la pureza.
6. Analizar los candidatos que contienen fracciones de péptidos por láser asistida por matriz de desorción ionización tiempo de vuelo (MALDI-AF) espectrometría de masas (ver Discusión) para identificar las especies de interés y confirme su masa esperada.
7. Combinar, congelar y liofilizar las fracciones de HPLC que contienen la pura, reticulado TM complejo de péptido y tener un peso en seco del producto final para determinar el rendimiento. Las fracciones con contenido de isopropanol alta no puede permanecer congelado. Si fracciones de péptidos secar hasta una película en lugar de un producto liofilizado esponjoso, volver a disolver la película completamente en un pequeño volumen de puro hexafluoroisopropanol (HFIP), congelar y liofilizar de nuevo. El producto HFIP tratados debería ser un cono pequeño y blanco que es fácil de punta a cabo y se pesa.

Representative Results

El nivel de expresión logrado en las fusiones TrpLE es variable y depende en gran medida de la secuencia de aminoácidos del péptido adjunto. Figura 3 muestra el análisis SDS-PAGE de pre-inducción (pista 1) y tiempo de cosecha-(carril 2) muestras de una cultura que produjo aproximadamente 120 mg de pura e intacta trpLE-DAP12TM fusión de 1 litro de cultivo y 4 ml matriz de níquel. Todos los de la fusión trpLE-DAP12TM fue localizado en el cuerpo de inclusión de precipitado (carril 4) en lugar de sobrenadante (carril 3).

Aproximadamente el 70% de la de níquel-purificado trpLE-DAP12TM fusión fue disulfuro de reticulado a la forma dimérica (Figura 3, carriles 5 y 6: muestras no reducidas y reducidas de eluato TFA). Este es un resultado típico para la fusión trpLE-DAP12TM, pero la eficiencia de reticulación variará con la colocación de las cisteínas de ingeniería. Los productos peptídicos DAP12TM no son fácilmente identificables en el total de las muestras de digestión con CNBr (carriles 7 y 8),pero la comparación de la fusión intacta y bandas TrpLE fragmentos en la muestra reducida a digerir (carril 8), indica que la digestión de la fusión fue de ~ 60% completa.

La Figura 4 muestra la separación de los productos de digestión por HPLC de fase inversa utilizando una columna de escala preparativa C3 ​​(capacidad total de unión ~ 200 mg de proteína). Debido a que el contenido aromático de la fusión es baja nos típicamente monitorear la absorbancia a 214 nm en lugar de 280 nm. Para esta ejecución de 90 mg de oxidado, CNBr-digerido trpLE-DAP12TM fusión se disolvió en 3 ml de ácido fórmico puro y se cargó en la columna en A 100% de disolvente (60% de H ₂ O, 40% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Productos unidas se eluyeron en un gradiente de dos etapas de 0-60%, seguido de 60-90% de disolvente B (75% de isopropanol, 25% de acetonitrilo, 0,1% de TFA) a un caudal de 10 ml / min. Los principales productos contenidos en cada fracción de acuerdo con el análisis de SDS-PAGE (Figura 5) se indican encima del cromatograma utilizando el assi códigosgned en la Figura 2. Consulte Optimización de gradiente de elución de HPLC en la sección de discusión para más detalles sobre la optimización de las condiciones de gradiente para las secuencias de péptidos diferentes.

Productos peptídicos que son fácilmente identificables en el SDS-PAGE (Figura 5) y MALDI TOF-(Figura 6) análisis de las principales fracciones de HPLC. Péptidos DAP12TM y, en nuestra experiencia, muchos otros péptidos hidrofóbicos TM, correr con las tasas de migración redujo significativamente en comparación con sus pesos moleculares esperados (3366 Dalton monómero y dímero 6730 Dalton para los ¹⁵ N-etiquetados especies que se muestran aquí). Este comportamiento está relacionado directamente con la cantidad de péptido cargado en el gel y los resultados en un continuo de pesos moleculares aparentes como la cantidad cargada se varía (datos no mostrados). Sin embargo, la alteración en la movilidad electroforética de pico 5 tras la reducción con DTT 100 mM (compárense las calles 7 y 8) lo identifica como el péptido reticuladoproducto. MALDI-TOF MS análisis confirma la identidad del péptido dimérico con el pico principal a 6729,2 Daltons y no revela otros productos principales (Figura 6). El rendimiento final de disulfuro puro reticulado homodímero DAP12TM péptido de esta preparación fue de 7,5 mg por litro de cultivo.

Figura 1. Secuencia de ADN de la región trpLE-DAP12TM codificación con su traducción en aminoácidos. Regiones clave de la secuencia del polipéptido se resaltan y un código de colores con etiquetas a la derecha. Los únicos internos de metionina (Met) y cisteína (Cys) residuos de bromuro de cianógeno (CNBr) de escisión y la reticulación oxidativa se destacan en cian y púrpura, respectivamente. HindIII y sitios de restricción BamHI (en negrita y subrayado) son únicos en el plásmido y may ser utilizado para reemplazar la secuencia de péptido de TM con otra secuencia de interés.

Figura 2. Diagrama esquemático del procedimiento. Los principales pasos en el protocolo se indican en las etiquetas de texto. Segmentos claves de la fusión trpLE-DAP12TM están codificados por color como en la figura 1. Los principales productos polipéptidos de la reticulación y medidas de resumen se etiquetan AF y aparecen aquí con su descripción y pesos moleculares esperados ⁽¹⁵ N-etiquetados): [A] fragmento trpLE: 13.769 Daltons; [B] intacto trpLE-DAP12TM fusión: 17.118 Daltons , [C] intacto trpLE-dímero DAP12TM fusión: 34.233 Daltons, [D] solo hendidas trpLE-dímero DAP12TM fusión: 20.482 Daltons; [E] monomérica DAP12TM péptido: 3366 Daltons; [F] dimérica DAP12TM péptido: 6730 Daltons. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 3. Análisis SDS-PAGE de trpLE-DAP12TM pasos expresión, purificación, reticulación y digerir las muestras de cultivo (carril 1, antes de la inducción, paso 2,5; carril 2, cosecha, paso 3,1). Preparación y la inclusión de muestras corporales (carril 3, sobrenadante; carril 4, pellets, paso 3,4) se redujeron con DTT 100 mM. TFA eluato de la columna de níquel (carriles 5 y 6; paso 6,1) y la muestra de post-CNBr (carriles 7 y 8; paso 6,3) se ejecute de forma no reducida (NR) y se redujo con DTT 100 mM (R) tal como se indica para confirmar la disulfuro de productos reticulado. * Péptido monomérico y dimérico productos E y F son pobremente visualizaron por tinción con Coomassie y por lo tanto no son detectables en este gel.

Figura 4. De fase inversa de la purificación por HPLC del dímero de disulfuro de DAP12TM reticulado. Oxidado, CNBr-digerido y se liofilizó trpLE-DAP12TM productos de fusión (90 mg) se disolvieron en 3 ml de ácido fórmico (100%) y se cargó en un Agilent ZORBAX SB-300 PrepHT C3 (21,2 x 150 mm) de columna de disolvente A (60% de H ₂ O, 40% de acetonitrilo, 0,1% de TFA). Un gradiente de dos etapas de 0-60%, seguido de 60-90% de disolvente B (75% de isopropanol, 25% de acetonitrilo, 0,1% de TFA) se hizo funcionar a una velocidad de flujo de 10 ml / min para eluir los productos consolidados. Las fracciones recogidas como de flujo a través (FT) y cuatro picos principales están marcados sobre la traza de absorbancia 214 nm (AU: arbitraria sinsu) y los principales productos contenidos en cada fracción se indican usando los códigos asignados en la Figura 2. El DAP12TM deseado reticulado pico del producto está sombreada.

Figura 5. SDS-PAGE análisis de fase inversa de HPLC productos. Flujo a través (FT) y el pico 1 muestras se ejecute de forma no reducida. Las muestras pico 2, 3 y 4 se llevaron a cabo tanto no reducida (NR) y se redujo mediante el tratamiento con 100 mM de DTT (R) para verificar la identidad de los productos reticulados disulfuro. Los productos principales en cada fracción (con sus códigos asignados en la Figura 2) fueron [FT, Pk1]: Un fragmento, trpLE; [Pk2]: B, intacto trpLE-DAP12TM fusión monómero y C, dímero de fusión intacta; [pk3]: D, sola-troceados trpLE-DAP12TM dímero y E, monomérico DAP12TM péptido; [PK4]: F, disulfuro reticulado dímero DAP12TM. * Como se ha discutido (ver reults representante), un cambio dependiente de la concentración de la movilidad hace que los productos de bajo MW en pk3 (NR y R) y PK4 (R) parecen ser diferentes pesos moleculares a pesar de que ambos productos son el péptido monomérico.

Figura 6. MALDI-TOF espectrometría de masas de análisis de HPLC-purificado dímero DAP12TM péptido. Una muestra de la fracción de HPLC 4 (1 l) se mezcló 1:1 con una solución saturada de ácido sinapínico (SA) de la matriz en acetonitrilo y manchado en la parte superior de una capa delgada de secado matriz SA de una solución saturada preparada en etanol. MALDI-TOF análisis revela un producto en el péptido DAP12TM esperado reticulado dímero de masasde 6730 Daltons (6729,2098; ¹⁵ N-etiquetados), así como un producto menor en 3365,7105, muy probablemente la especie de doble ionizadas. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Discussion

Expresión de trpLE-TM fusiones. En nuestra experiencia, trpLE-TM fusiones se expresó mal en medio de cultivo rico a 37 ° C, y las condiciones de cultivo descritas aquí han demostrado tener éxito para muchas secuencias diferentes que contienen de uno a cuatro dominios TM con rendimientos que oscilan 50 a 150 mg / L de fusión puro, intacto. Codificación de fusiones de tres o cuatro fragmentos de TM GPCR (CCR5 humano TM1-TM3 y TM4 TM7-, respectivamente) o un fragmento de núcleo catalítico de la peptidasa humana péptido señal (cuatro dominios TM; ver ref ¹⁵⁾ representan la más baja en este rango de expresión niveles, mientras que las variantes DAP12TM estrechamente relacionadas con la secuencia utilizada aquí representan el extremo más alto de la gama (datos no publicados). La concentración óptima de IPTG se debe determinar experimentalmente para cada nueva secuencia. Nuestro estándar es de 0,1 mM, y concentraciones más altas (hasta 1 mM) suelen dar lugar a un rendimiento significativamente reducido debido tanto a menores niveles de expresión y menor densidad de cultivo unacosecha t (véase por ejemplo la Figura 1A en la referencia ^7).

Las variaciones en el protocolo presentado. El protocolo presentado aquí describe la producción de un disulfuro reticulado complejo TM péptido, el homodímero DAP12TM ^8. Alternativamente, el protocolo se adapta fácilmente a producir péptidos monoméricos omitiendo las dos etapas de lavado diseñado para eliminar el agente reductor y oxidar los productos consolidados (4,3 y 4,4). Hemos utilizado anteriormente otra variación del procedimiento descrito aquí para producir una covalentemente estabilizado TM complejo péptido que representa el trimeric DAP12-DAP12-NKG2C TM montaje (véase la referencia ⁸ y métodos descritos en el mismo). En esta aplicación, un 1-TM-trpLE DAP12 fusión y una fusión 2-TM-trpLE DAP12-NKG2C se mezclaron en la etapa de cosecha de cultivo antes de la preparación de cuerpos de inclusión (etapa 3.1-3.2). El procedimiento incluye un paso adicional HPLC para aislar el heterodimérico reticulado trpLEproducto de la fusión eluato ácido (paso 5,3) antes de CNBr resumen. C3 purificación de los productos peptídicos como resultado la recuperación de un disulfuro reticulado DAP12TM dímero en el que una hebra realiza la NKG2C dominio TM como un marco en el C-terminal de la fusión. La estructura de RMN solución de este complejo en micelas de detergente confirmó que el dominio TM NKG2C montado con DAP12 en su nativo, anti-paralelo orientación ^8. Los pasos adicionales en esta variación redujo significativamente el rendimiento del producto final: una preparación típica produjo 8-10 mg de péptido "trímero" de 4L de una fusión combinada con un exceso de la segunda. Esta variación representa un buen protocolo de partida para los investigadores que deseen producir estabilizados por puentes disulfuro complejos que contienen dos diferentes secuencias de TM.

Notas sobre la purificación de afinidad con níquel. La elución de proteína a partir de la columna de níquel se secó usando ácido concentrado es un procedimiento inusual y no es susceptible de volver-El uso de la matriz de níquel. Los intentos para eluir el extremadamente hidrófobos trpLE-TM fusiones utilizando imidazol o EDTA resultó en una recuperación incompleta de la proteína y las especies reticuladas fueron retenidos preferentemente en la columna (resultados no publicados). La cantidad recomendada de matriz de níquel y el protocolo durante la noche lote de unión han sido cuidadosamente optimizado para saturar la matriz con trpLE-TM proteína y de ese modo minimizar la co-purificación de contaminantes. En forma rutinaria recuperar productos muy puros con rendimientos que superan significativamente la capacidad anunciada unión de la Sigma SU-Select níquel matriz de afinidad (15-20 mg / ml de resina). La elución ácida también elimina los pasos intermedios necesarios para la transición a la digestión con CNBr, y el aumento del rendimiento de los productos reticulados más que compensa el costo de la matriz de níquel, en particular cuando el marcaje con isótopos estables costosos reactivos para RMN.

Bromuro de cianógeno digerir condiciones. Lanzamiento de lafusionados péptidos de TM de trpLE en CNBr se realiza normalmente utilizando 70% de ácido fórmico como disolvente debido a que tanto la velocidad de reacción y la solubilidad de proteínas son altamente favorables en estas condiciones. Sin embargo, los tiempos de tratamiento debe mantenerse relativamente corto (menos de 1 hora para digerir) para evitar la esterificación formil de residuos de serina y treonina ^16,17 y, posiblemente, I-formilación de los residuos de triptófano ^18, modificaciones que son detectables por espectrometría de masas como especie cuya masa observada es +28 (n) Daltons en relación con la masa esperada. La preferencia por TFA como se describe aquí evita estas modificaciones por completo. La escisión enzimática de una fusión trpLE-TM con el factor Xa de la proteasa en 1% de Triton X-100 se ha descrito ^11, pero la escasa solubilidad de la mayoría de trpLE-TM fusiones y la complicación de la inaccesibilidad del sitio de escisión en micelas de detergente probablemente limitar la utilidad general de los este enfoque.

HPLC de fase inversa de purificación de Peptide productos de la digestión con CNBr es el paso más difícil en este procedimiento y es probable que requiera de optimización para cada nuevo trpLE-TM secuencia. Las siguientes observaciones proceden de procesar muchas secuencias diferentes y probablemente cierto para la mayoría de las fusiones trpLE-TM:

Selección de fase estacionaria Encontramos Agilent ZORBAX Estable-Bond columnas C3 (300 Å de tamaño de poro; tamaño de partícula 5 micras). A ser una fase superior estacionaria en términos de selectividad, poder de resolución y estabilidad bajo una fuerte exposición a ácido concentrado. Semi-preparativa (9,4 mm de diámetro) y preparativa escala (21,2 mm de diámetro) los tamaños están disponibles y han funcionado muy bien en nuestras manos. C4, difenilo y cianopropilo fases estacionarias también puede proporcionar selectividad útil péptido alternativa en un rango de hidrofobicidad similar en comparación con C3.

Elaboración de productos de digerir para HPLC. Disolución de productos liofilizados CNBr digerir en limpio paramic ácido proporciona los mejores resultados para la separación HPLC. Preparación en TFA o disolventes orgánicos tales como acetonitrilo, dimetilformamida y trifluoroetanol a menudo resulta en una menor solubilidad, reducción de la columna de unión y / o la elución de los productos en picos anchos que contienen múltiples especies. Se debe tener cuidado para preparar productos en ácido fórmico inmediatamente antes de la carga de columna ya que la exposición prolongada puede resultar en la modificación de cadenas laterales de péptidos formil ^16-18 como se discutió anteriormente.

Optimización de HPLC gradiente de elución. Generalmente comenzamos con 10-20% de acetonitrilo o isopropanol al 5-10% en agua con TFA al 0,1% como disolvente A. TrpLE-TM fusiones y sus productos de digestión disuelve en ácido fórmico se unirá a la columna C3 en como tanto como 40% de acetonitrilo como se muestra aquí (Figura 4). Gran parte de la trpLE fragmento liberado puede fluir a través bajo estas condiciones (Tenga en cuenta que trpLE fragmento es el producto de la proteína sólo en el FTfracción: Figura 5, carril 1), y hemos tomado ventaja de esta observación para aumentar la capacidad general de unión de la columna para los productos deseados. Acetonitrilo e isopropanol son muy eficaces como disolventes de gradiente, y que llegan a menudo a nuestras condiciones de gradiente final mezclando pre-existentes soluciones de disolventes para modificar los perfiles de elución, lo que resulta en las recetas a veces impares, pero eficaz, como el 75% de isopropanol, 25% de acetonitrilo, 0,1 % de solución de TFA utilizado como solución B para la purificación DAP12TM se muestra aquí. Los productos extremadamente hidrofóbicos que fueron problemáticos han sido eluyó usando acetonitrilo o isopropanol con adición de hasta un 10% trifluoroetanol (TFE) y concentraciones crecientes de TFA (hasta 0,3%) en A y B (resultados no publicados). Otros han reportado buenos resultados con butanol / ácido acético fases móviles con una fase estacionaria C4 ^9.

Análisis de los productos de digestión. Tanto de la técnica de análisis de los principaless utiliza aquí, SDS-PAGE y MALDI-TOF MS, puede ser complicado por la naturaleza extremadamente hidrófobo de trpLE-TM productos. Liofilizadas muestras analíticas de CNBr / TFA reacciones digerir y fracciones de HPLC veces ejecutar como agregados de alto peso molecular en geles de SDS-PAGE. Encontramos que el tratamiento de muestras liofilizadas con un pequeño volumen de HFIP y re-liofilización antes de la preparación para SDS-PAGE a menudo soluciona este problema. TM secuencias de péptidos también no puede ionizar fácilmente durante MALDI-TOF MS análisis, y por lo tanto pueden dar señales muy débiles. Hemos utilizado un procedimiento optimizado para la preparación de muestras de péptidos de TM en el que primero una solución saturada de ácido sinapínico (SA) en etanol en la placa, y se secó para formar una capa delgada y uniforme de la matriz. Una muestra de péptido que contiene fracción de HPLC mezclado 1:1 con una solución saturada de SA en acetonitrilo se vio entonces en la parte superior de la capa de matriz seca. En nuestras manos, este método proporciona entre dos y seis veces mayor de la señal-a-ruido comparard para detectar el péptido: SA mezcla directamente sobre una placa limpia MALDI.

Aplicaciones posteriores. Métodos para la reconstitución de TM complejos de péptidos en sistemas lipídicos o detergente para la solución de RMN y otras aplicaciones posteriores varían mucho y por lo general debe ser cuidadosamente medida para cada nuevo sistema y la aplicación. Una discusión completa de los parámetros que intervienen tanto, es mucho más allá del alcance de este artículo protocolo. Para los detalles de la preparación de muestras de solicitudes admitidas mediante RMN solución, remitimos al lector a estas revisiones recientes sobre el tema y las referencias en él ^1,19.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanogen bromide	ALDRICH	P.No- C91492,CAS-506-68-3	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
Trifluoroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
2-Mercapt–thanol	SIGMA-ALDRICH	P.No M7154, CAS Number 60-24-2	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol	SIGMA-ALDRICH	Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns.
Formic acid	Merck KGaA	K41186564	Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Urea	UNIVAR, AJAX FINECHEM	Product Number, 817, CAS-No 57-13-6	When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes.
GUANIDINE HYDROCHLORIDE	Amresco	P.No-M110, CAS Number: 50-01-1	Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant.
TRITON X-100	SIGMA	Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1	Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent
His-Select Nickel-Affinity gel	SIGMA-ALDRICH	Catalog Num- P6611	IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins.
(-)-Glutathione, oxidized	SIGMA-ALDRICH	Catalog num 150568
Misonix S-3000 sonicator	QSONICA	S-3000 (discontinued)	Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700.
RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3	Bio-Rad Laboratories	Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705	Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent.
Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size	Agilent	Product No: 895150-909	Reversed-phase HPLC colum
NuPAGE 12% Bis-Tris Gels	Life Technologies	NP0341BOX	Pre cast gels for protein electrophoresis
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO	Thermo Scientific	Product No: 87724	Sample dialysis