두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

Summary

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다.<em> 생체 내</em> 두 광자 이미징 방법은 유전자 인코딩 기자를 통해 개인의 대뇌 피질의 뉴런 이러한 분자 변화의 추적을 허용하는 여기에 설명되어 있습니다.

Abstract

경험에 대한 응답으로 변경하는 뇌의 능력은 건강한 뇌 기능을 위해 필수적이며,이 과정에서 이상이 뇌 장애의 ^1,2의 다양한에 기여합니다. 더 나은 뇌 회로가 동물의 경험에 반응하는하여 메커니즘을 이해하려면 라이브 동물에 시간의 연장 기간 동안, 뉴런의 주어진 집합의 경험에 의존하는 분자 변경 사항을 모니터링 할 수있는 능력이 필요합니다. 경험 및 관련 신경 활동이 뉴런 ^1,2에서 유전자 발현 변화를 실행하는 것으로 알려져 ^{있습니다하지만,} 방법의 대부분은 이러한 변화를 감지하는 것은 여러 일 동안 동일한 뉴런의 반복 관찰을 허용하지 않습니다 또는 개별 뉴런에게 ^3를 관찰하기에 충분한 해상도를 필요가 없습니다 ^4. 여기, 우리는 위에 각각의 대뇌 피질의 뉴런의 경험에 의존 유전자 발현 변경 사항을 추적하기 위해 유전자 코드 형광 기자와 두 광자 현미경 생체에 결합하는 방법을 설명 일상의 경험 코스입니다.

잘 구축 된 경험에 의존 유전자 중 하나는 활동 – 규제 cytoskeletal 관련 단백질 (아크) ^{5,6입니다.} 아크의 전사는 빠른 속도이며, 매우 심화 neuronal 활동에 ^{3 유도,} 그리고 단백질 제품은 glutamate 수용체 및 장기 시냅스 소성 ⁷ endocytosis를 규정한다. 아크의 표현이 널리 ³ 특정 행동에 참여 neuronal 회로를지도에 분자 마커로 사용되었습니다. 이러한 연구의 대부분에서 아크 표현식은 고정 뇌 섹션에 원위치 하이브리드 또는 immunohistochemistry에 의해 발견되었다. 이러한 방법은 아크의 표현은 아크 식의 세포 패턴 일 동안 반복적으로 또는 독특한 경험을 여러 에피소드와 함께 변경 될 수는 조사되지 않은 방법을 행동 경험, 이후 흥분성의 뉴런의 일부에 번역 된 것으로 밝혀 있지만.

ntent는 "> 생체에서 두 광자 현미경은 살아있는 뇌 ^8,9의 경험에 의존 세포 변경 사항을 검토 할 수있는 강력한 방법을 제공합니다. 두 광자 현미경에 의해 라이브 뉴런의 아크 식의 검사를 활성화하려면, 우리는 이전에 생성 한 가짜을 마우스 줄에 GFP 기자가 내생 아크 프로모터 ^(10)의 통제하에 배치됩니다.하는이 프로토콜은 수술 준비와 라이브 동물의 neuronal ensembles 경험에 의존 아크 – GFP 표현 패턴을 추적 이미징 절차를 설명합니다.이 방법에서는 , 만성 두개골 창가 먼저 관심 대뇌 피질의 지역으로 아크 – GFP 마우스에 이식되었다. 그 동물 한 후 반복적으로 며칠 동안의 원하는 행동 패러다임 후 두 광자 현미경에 의해 이미징했다.이 방법은 수행 동물 일반적으로 적용 할 수 있습니다 다른 형광 기자 경험에 의존 분자 변경 ^4.

Protocol

아래에 설명 된 실험 절차는 정신 건강 동물 관리 및 사용위원회의 국립 연구소에 의해 승인 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 있었다. 1. 사전 수술 준비 무균 수술 전에 뜨거운 구슬 살균기에있는 모든 도구를 청소, 70 %의 에탄올과 수술 사이트를 청소하고, 깨끗한 드롭 옷을 내려 놓았다. 멸균 장갑을 착용한다. ML / g, intrap…

Representative Results

이 프로토콜은 살아있는 동물에서 개별적으로 대뇌 피질의 뉴런의 경험에 의존하는 분자 변경 사항을 추적 할 수있는 방법을 설명합니다. 만성 두개골 창이 먼저 유전자 표현의 형광 기자를 들고 마우스에 관심이 대뇌 피질의 영역으로 생성됩니다. 두 광자 현미경 그런 다음 각각의 뉴런에 behaviorally 유도 분자 변화를 관찰하고 여러 일 동안 뉴런의 같은 세트에서의 변경 (그림 1)을</stro…

Discussion

생체 이미징 방법에 여기에 설명 된 라이브 동물의 여러 일 동안 뉴런의 같은 세트에서 아크 유전자 발현의 변화 반복 시험을 할 수 있습니다. 그것은 다양한 행동 경험에 대한 응답에서 개별 뉴런의 신경 소성 관련 분자 역학에 대한 정보를 얻을 수있는 효율적이고 다양한 방법입니다. 이러한 현장 하이브리드 화 및 immunostaining의 표준 histochemical 방법은 해상도 ^{3 개?…}

Materials

Name of the Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
FV1000 multi-photon laser scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	Imaging
Dissection microscope	Omano	555V107	Surgery
Stereotaxis surgery stage for mice	Harvard Apparatus	726335	Surgery
20X or 25X water immersion objective	Olympus	XLPL25XWMP	Imaging
Microscope stage with head-fixation frame	Custom made	N/A	Imaging
Fine forceps	Fine Science Tools	11251-20	Surgery
Dental drill burr	Fine Science Tools	19007-05	Surgery
CCD camera	QImaging	QICAM 12-bit	Imaging