Etichettatura di singole cellule nel sistema nervoso centrale di<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Presentiamo una tecnica per l'etichettatura singoli neuroni nel sistema nervoso centrale (SNC)<em> Drosophila</em> Embrioni, che consente l'analisi della morfologia neuronale da una luce trasmessa o microscopia confocale.

Abstract

In questo articolo viene descritto come etichettare singolarmente i neuroni del sistema nervoso centrale dell'embrione di Drosophila melanogaster mediante iniezione juxtacellular del DiI lipofilo fluorescente marker di membrana. Questo metodo permette la visualizzazione della morfologia delle cellule neuronali nei minimi dettagli. È possibile etichettare qualsiasi cella nel CNS: corpi cellulari dei neuroni bersaglio sono visualizzati sotto DIC ottiche o mediante espressione di un marcatore fluorescente genetico come GFP. Dopo etichettatura, la DiI può essere trasformato in un permanente macchia marrone da fotoconversione per permettere la visualizzazione della morfologia cellulare con luce trasmessa e ottica DIC. In alternativa, le cellule DiI-etichetta possono essere osservati direttamente con microscopia confocale, permettendo geneticamente introdotte proteine ​​reporter fluorescenti da colocalised. La tecnica può essere utilizzata in qualsiasi animale, indipendentemente dal genotipo, rendendo possibile analizzare fenotipi mutanti a risoluzione singola cella.

Introduction

La conoscenza della morfologia neuronale a livello delle singole celle è un presupposto fondamentale per la comprensione connettività neuronale e la funzione del SNC. Così, fin dai primi giorni di neuroscienze, i ricercatori hanno cercato di sviluppare singole tecniche di marcatura delle cellule (vedi ⁷ per una trattazione storica di questo numero). Metodi classici come colorazione di Golgi forniscono eccellente risoluzione di morfologia neuronale ma non sono adatti se si cerca di etichettare un particolare tipo di neurone in modo diretto, come colorazione avviene in modo casuale. Lo sviluppo di metodi per la colorazione di cellule singole mediante iniezione intracellulare o juxtacellular di coloranti da un microelettrodo affrontato l'obbligo di etichettatura specifica.

L'applicazione di una singola iniezione di Drosophila neurone colorante rappresentato una sfida importante, a causa delle piccole dimensioni sia dell'organismo e suoi neuroni. Tuttavia, la colorazione singolo neurone di embrionale Drosophila </em> Neuroni è stato raggiunto a metà degli anni 1980 nel laboratorio di Corey Goodman ^15. Mentre il metodo è stato eminentemente utile e ha fornito alcuni spunti importanti sui meccanismi per lo sviluppo neuronale in Drosophila nel corso degli ultimi 20-30 anni (ad esempio, ^{2, 10),} molti lavoratori hanno evitato che, in gran parte a causa delle sue esigenze tecniche.

La disponibilità in anni più recenti di tecniche genetiche per l'etichettatura neuronale in Drosophila ha anche contribuito l'impopolarità di singola iniezione colorante neurone. Espressione GAL4-diretto di membrana mirati costrutti GFP in grado di fornire un'eccellente risoluzione della morfologia neurale ^{1, 20.} Tuttavia, questo metodo ha alcune limitazioni: la spesso inevitabile espressione di GFP in cellule multiple possono oscurare la struttura dei singoli neuroni e una linea pilota GAL4 possono non essere disponibili per guidare l'espressione in un neurone specifico di interesse. Il marcm (Analisi Mosaico con un addettoMarker ressible Cell) Metodo ⁸ può fornire etichettatura di ogni neurone essenzialmente a livello di cella singola, ma non può essere usato con successo nell'embrione e larva presto a causa della lenta rotazione della proteina GAL80.

Date queste limitazioni di etichettatura genetica, noi crediamo che una singola iniezione colorante neurone nell'embrione Drosophila rimane una tecnica preziosa e merita una più ampia applicazione. Per promuovere questo obiettivo, forniamo qui una descrizione dettagliata del metodo. Un'illustrazione della sua potenza è fornito dal nostro conto recente della morfologia del set completo di interneuroni in neuromeres addominali dell'embrione ritardo Drosophila ^14. Questo studio, che ha rivelato sia la variabilità morfologica dei singoli tipi di cellule neuronali e dei principi di organizzazione neuromere nel SNC dell'embrione, non sarebbe stato possibile con qualsiasi altro metodo di etichettatura attualmente disponibile.

Protocol

Abbiamo usato due varianti leggermente diverse del singolo metodo di etichettatura neurone nei nostri laboratori. Le differenze riguardano la raccolta degli embrioni, dechorionisation, devitellinisation e gradini sfilettatura embrioni. Figura 1 fornisce una panoramica dei passaggi comuni e divergenti delle varianti. 1. Preparazione di micro-aghi per la dissezione dell'embrione e Micropipette per iniezione Dye Aghi vetro per dissezione dell'embrione sono tr…

Representative Results

La figura 4 illustra i risultati tipici della tecnica, si descrive qui. Figura 4A illustra un esempio di una piena interneurone DiI singolo che è stato pulito photoconverted. Si dimostra in modo esauriente la quantità di dettagli questi offrono preparazioni. Se visto sotto ottiche DIC contesto spaziale della cella etichettata all'interno del tessuto non marcato circostante diventa visibile, ad esempio, la posizione del corpo cellulare all'interno della corteccia e del…

Discussion

Uno dei principali vantaggi di Drosophila come sistema modello è che permette l'analisi di sviluppo e funzione del livello di singole cellule. Questo è particolarmente utile per quanto riguarda il sistema nervoso, in cui la diversità di tipi di cellule è eccezionalmente elevata e la funzione e la morfologia delle cellule vicine può essere totalmente differente.

Il metodo qui presentiamo permette l'etichettatura dei singoli neuroni con un colorante che può essere trasfo…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
			REAGENTS
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI	Invitrogen/Molecular Probes	D-282	1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde	Merck Millipore		7,4 % in PBS
Glycerol	Roth	3783	70% in PBS
Heptane Glue	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			EQUIPMENT
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2	to view and document labelings in fluorescence
DC – amplifier	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	to perform the labelings
Coverslips	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Coverslips	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Dissecting Microscope	Leica	MZ8	to prepare and disect embryos
Flat Capillaries	Hilgenberg		outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries	Science Products	GB 100 TF 8P
Micromanipulator R	Leica		to perform the labelings
Model P-97	Sutter Instruments		to pull capillaries
Object Slides	Marienfeld Superior	1000000
Scientific Microscope	Zeiss	Axioskop 2 mot	to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope	Olympus	BX50	to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera	Sony/AVT Horn	Sony MC3255	to record labelings after photoconversion

Table 1.