Ex Vivo Blood Red emolisi test cellulare per la valutazione degli agenti Endosomolytic pH-sensibile per la consegna dei farmaci citosolico Biomacromolecular

Summary

Un saggio di emolisi può essere usato come un rapido, ad alta resa di schermo citocompatibilità sistemi di rilascio di farmaci e l'attività endosomolytic per la consegna del carico intracellulare. Il saggio misura la rottura di membrane eritrocitarie in funzione del pH.

Abstract

Doppi strati di fosfolipidi che costituiscono endo-lisosomiale vescicole possono rappresentare un ostacolo alla consegna di farmaci biologici a bersagli intracellulari. Per superare questo ostacolo, una serie di trasportatori di farmaci sintetici sono stati progettati per interrompere attivamente la membrana endosomiale e consegnare cargo nel citoplasma. Qui, descriviamo il saggio emolisi, che può essere usato come un rapido, ad alta resa per la schermata citocompatibilità e attività endosomolytic dei sistemi intracellulari drug delivery.

Nel saggio emolisi, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che imitano extracellulari, endosomali precoce e tardiva endo-lisosomiali ambienti. A seguito di una fase di centrifugazione a pellet intatti cellule rosse del sangue, la quantità di emoglobina rilasciata nel terreno viene misurata spettrofotometricamente (405 nm per migliore dinamica). Il rosso per cento rottura delle cellule del sangue viene poi quantificato rispetto al controllo positivo samples lisate con un detergente. In questo sistema modello la membrana eritrocitaria funge da surrogato per la membrana lipidica a due strati che racchiudono endo-lisosomiale vescicole. Il risultato desiderato è emolisi trascurabile a pH fisiologico (7,4) ed emolisi robusta in endo-lisosomiale intervallo di pH da circa pH 5-6,8.

Introduction

Sebbene vi siano molti potenziali obiettivi terapeutici impatto elevato all'interno della cellula, la consegna intracellulare di agenti rappresenta una sfida significativa. Spesso, i farmaci biologici, in particolare, vengono internalizzati dalle cellule e trafficata in vescicole che o portare al degrado del loro contenuto tramite l'endo-lisosomiale via, o vengono trasportati indietro fuori dalla cellula tramite esocitosi. ¹ In quest'ultimo processo, il pH interno delle vescicole viene acidificata a circa 5-6, che è il pH ottimale per l'attività di enzimi che funzionano in questo vano, ad esempio il lisozima. ²

Recentemente, un certo numero di materiali sono stati specificamente progettati per sfruttare l'acidificazione di endosomi per facilitare l'erogazione citosolico del loro carico. Un esempio di questo approccio utilizza nanoparticelle polimeriche sintetiche, micelle cui anima è zwitterionici e carica neutra a pH fisiologico (cioè 7,4). Tuttavia, a pH 6,0- 6,5, i polimeri diventano protonati e acquisire una carica positiva netta che destabilizza il nucleo micelle, e segmenti polimerici esposti interagire e distruggere la membrana endosomiale. Questa attività è stato dimostrato per promuovere la fuga endosomiale di peptidi e acido nucleico-terapie basate, consentendo loro di accedere ai bersagli citosolico. ^3,4 Altri esempi di metodi sviluppati per mediare fuga endosomiale che distruggere la barriera membrana includono 'fusogenico' peptidi o proteine ​​che possono mediare la fusione della membrana o transitoria formazione di pori nel doppio strato fosfolipidico. ⁵ omopolimeri di acidi acrilici anionici alchile come acido poli (propylacrylic) sono un altro approccio ben studiato, e in questi polimeri, lo stato di protonazione di acido carbossilico detta sospensione transizione in una idrofobica, membrana dirompente stato in endo-lisosomiale intervalli di pH. ^6,7

Un sistema modello utile per lo screening di comportamento endosomolytic è l'indirizzox pH-dipendente vivo dosaggio emolisi. ⁸ In questo sistema modello, la membrana eritrocitaria serve come un surrogato della membrana a doppio strato lipidico che racchiudono endo-vescicole lisosomiali. Questo modello generalizzabile è stato utilizzato da altri per valutare il comportamento endosomolytic di penetrazione cellulare peptidi e altri sistemi polimerici consegna del gene. ^8-11 In questo esperimento, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che mimano extracellulari (7.4), precoce endosomali (6.8), e la fine del endo-lisosomiale (<6.8) ambienti. La quantità di emoglobina rilasciata durante il periodo di incubazione è quantificato come misura di lisi dei globuli rossi, che viene normalizzato alla quantità di emoglobina rilasciata in campioni di controllo positivi lisate con un detergente.

Da screening di una piccola libreria di materiali di prova potenzialmente endosomolytic, si può dedurre che i campioni che non producono emolisi a pH 7.4, ma orlo significativamente elevatiolysis a pH <6.5, saranno i candidati più efficaci e cytocompatible per la consegna della droga citosolico. Materiali che soddisfano questi criteri dovrebbe rimanere inerte e non indiscriminatamente distruggere le membrane a doppio strato lipidico (cioè che potrebbe causare citotossicità) fino ad essere esposto ad una diminuzione del pH locale dopo interiorizzazione in endo-compartimenti lisosomiali.

In questo protocollo, eritrociti sono isolati da un donatore umano e co-incubate a pH 5,6, 6,2, 6,8, 7,4 o con agenti farmaci sperimentali endosomolytic consegna. Eritrociti intatti sono pellettizzati, ei surnatanti (contenenti emoglobina rilasciata da eritrociti lisati) vengono analizzati per l'assorbanza caratteristica di emoglobina mediante un lettore di piastre (Figura 1).

Protocol

1. Preparazione e sterilizzazione di buffer e agenti di test 150 mM NaCl tampone: sciogliere 4,383 g di cristalli di NaCl in 500 ml di acqua Nanopure. Buffer pH: Preparare tamponi fosfato a pH 5.6, 6.2, 6.8, e 7.4 mescolando quantità appropriate di monobasico e sodio fosfato bibasico. Se i campioni devono essere sottoposti a valori di pH più bassi (pH <5.6) poi un buffer più appropriato, come il tampone citrato, dovrebbe essere usato. Ricette del buffer sono facilmente disponibili, e …

Representative Results

In genere, gli agenti che presentano ideale pH-dipendente comportamento emolitica hanno il più alto potenziale per la consegna citosolico di farmaci, acidi nucleici, o altre molecole bioattive. Questo è esemplificato da Agent # 1 come rappresentato in figura 2, che presenta emolisi minima a pH 7,4, ma un forte aumento comportamento emolitica a intervalli di pH endosomiali (<6,5). Alcuni agenti possono esibire livelli significativi di comportamento emolitica a intervalli di pH fisiologici (Age…

Discussion

pH-sensibili polimeri o altri agenti destinati endosomolytic funzione può essere rapidamente ed efficacemente proiettato sulla base di lisi dei globuli rossi a pH incontrate in endosomi (Figura 1; pH 6,8 – endosoma precoce, pH 6,2 – endosoma tardi, pH 5,6 – lisosoma). ^14-17 pH-dipendente emolisi è stato utilizzato per schermare la capacità dei vettori di mediare endosomal rilascio di peptidi terapeutici biomacromolecular (ad esempio, siRNA, ODN, proteine), ed i risultati di questa…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
BD Vacutainer – K2EDTA Vacutainer Tubes	Fisher Scientific	22-253-145	For blood collection
BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge	Fisher Scientific	02-665-31	For blood collection
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter	Fisher Scientific	22-289-953	For blood collection
BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	For blood collection
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	For blood collection
Hydrochloric acid (conc.)	Fisher Scientific	A144-500	For adjustment of pH of D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Positive control
Dulbecco’s PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-2C	For plate-reading at the end of the assay.
BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene	Fisher Scientific	08-772-17	For incubation of red blood cells with experimental agents.