림프구와 손쥐 Peyer의 패치에서 수지상 세포를 분리하고 Immunostaining
Summary
Peyer의 패치에있는 셀의 특정 subpopulations (조달청), 창자 관련 림프의 조직의 주요 유도 사이트의 면역 기능을 이해 증가 관심이 있습니다. 여기 흐름 cytometric 분석 및 immunostaining을위한 PP cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비 병렬 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Peyer의 패치 (조달청) 창자 관련 림프 조직의 핵심 부품 (갈트)이며, 장 immunosurveillance과 항상성에 중심 역할을한다. 장 루멘의 미립자 항원과 미생물이 지속적으로 대과 – 관련 상피 (FAE)에 PP M 세포에 의해 샘플 및 기본 수지상 세포 네트워크 (코디네이터), 대 식세포 및 림프구로 이송됩니다. 이 문서에서는, 우리는 손쥐 조달청은 (i) 단일 세포 현탁액에 dissociated이며, 유동 세포 계측법을 받게하고 (ii) cryosectioning 및 immunostaining을 준비하는 프로토콜을 설명합니다. 유동 세포 계측법를 들어, 조달청은 기계적으로 dissociated하고 상피 세포 및 대형 쓰레기의 무료 단세포 현탁액을 생성하기 위해 70 μm 멤브레인을 통해 필터링합니다. 20-25 조달청 (4 마우스에서)를 시작으로,이 신속하고 재현 방법은> 2.5 인구를 산출 × 10> 90 % 세포 생존 능력 6 셀. cryosectioning, 신선한 들어지적인 절연 조달청은 cryomicrotome을 사용하는 다음 최적의 절삭 온도 (OCT) 중간, 액체 질소 스냅인 – 냉동 및 sectioned에 몰두하고 있습니다. 조직 섹션 (5-12 μm)은 아세톤이나 메탄올로 고정, 공기 건조 있으며, 다음 immunolabeling를 받게.
Introduction
Peyer의 패치 (조달청) 인간과 생쥐 (그림 1)의 소장에 걸쳐 현재의 조직 림프 모낭 매크로 집계하고 점막 면역 응답이식이 항원, 공생 박테리아, 미생물 병원균, 그리고 구두 백신에 대해 시작되는에서 주요 사이트를 구성 1-4. 같은 창 자간 막 림프절과 같은 다른 주변 림프 조직과는 달리, 조달청은 수입 성의 lymphatics가 부족합니다. 조달청에서 같은 적응 면역 반응은 장 내강에서 파생 된 항원에 대한 응답으로 구동 때문입니다. luminal 항원의 샘플링은 M 세포로 알려진 enterocytes 및 항원 샘플링 세포 모두로 구성되어 있습니다 대과 – 관련 상피 (FAE)에 의해 달성된다. FAE 아래의 하위 상피 돔 (SED) 지역에, 대 식세포, B 세포, 그리고 CD4 + T 세포를 5-9로 혼합 된 수지상 세포 (DC가)의 네트워크에 자리 잡고 있습니다. 각 PP 림프 follicl의 핵심e는 follicular의 수지상 세포 (FDCs)와 T 세포 풍부한 interfollicular 지역으로 둘러싸인 B 세포 풍부한 중앙 본원 센터입니다. 이가 + B 세포 plasmablasts와 CD4 + 효과기 및 메모리 셀의 개발에 조달청 결과로 항원 샘플링 그 종자 주위의 얇은 판의 propria와 점막 침략자에 대한 광범위한 내성을 제공합니다.
조달청의 항원 샘플링, 처리, 및 프리젠 테이션과 관련된 복잡한 immunologic 이벤트를 해부하는 것은 PP 세포는 장의 점막에 총 림프 세포의 아주 작은 일부를 구성하는 것을 생각하면 부담스러운 작업입니다. 이 환경에서 세포의 체외 특성화에에 도움이하기 위해, 우리는 흐름 cytometric 및 기능 분석뿐만 아니라, immunofluorescence 현미경과 immunohistology에 대한 cryosections을 PP 준비하기위한 프로토콜 총 마우스 PP 전지를 준비하기위한 프로토콜을 제공합니다. mous의 절연, 특성 및 immunostaining에 대한 프로토콜전자 PP 전지는 이러한 기술 할 5,6,9-11를 인용 25 년 이상 거슬러 올라가는 많은 참조가 있다는 사실에 의해 입증, 본질적으로 소설이 아닙니다. 오히려, 우리의 프로토콜은 처음 조달청를 수집 조사의 간소화 (및 영상) 메소드를 제공합니다. 우리가 설명하는 기술을 쉽게 습득하고 쉽게> 90 % 세포 생존과 세포의 큰 숫자를 얻을 수 있습니다. cryosectioning 프로토콜은 이상적으로 immunofluorescence 얼룩 및 공 촛점 이미징에 적합 높은 재현 시리얼 섹션을 산출. 또한, 우리 프로토콜은 두 개의 다른 최근 주피터 기사를 보완합니다. 첫 번째는, 후쿠다 및 동료에 의해, PP M 세포 12 병원성 박테리아의 이해를 평가하는 출혈도 잡았 ileal 루프 assays의 사용을 설명합니다. 다른 하나는, Geem 및 동료에 의해 DCS 및 마우스 장 점막에서 대 식세포의 분리 및 특성을 설명하지만, 명시 적으로 분석 13 일부터 조달청을 제외.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서는, 우리는 immunostaining에 대한 흐름 cytometric 및 기능 분석 및 cryosections위한 단일 셀 준비를 PP 준비를 위해 병렬 프로토콜을 제공합니다. 두 가지 방법은 흐름 cytometer와 그라 이오 스탯을 사용할 수 있습니다 제공 높은 재현하고 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 처음 수사를 위해이 비장에 비해, 조달청의 총 세포 수율이 상대적으로 빈약하다고 지적한다. 그럼에도 불구하고, 프로토콜은 우…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 세포 분석 및 파라핀 섹션의 준비 헬렌 존슨 (워즈 워드 센터 동물 조직 병리학 코어)의 도움을 Renjie 노래 (워즈 워드 센터 유동 세포 계측법 코어)을 감사드립니다. 우리는 공 촛점 현미경 및 이미지 수집과 도움 박사 리처드 A. 콜 (워즈 워드 센터 라이트 현미경 핵심)을 감사드립니다. 우리는 애니메이션 지원 앤디 벤틀리 (워즈 워드 센터 사진 및 삽화)을 인정하고 싶습니다.
MDJ은 생명 과학 연구 재단, 하워드 휴즈 의학 연구소 (HHMI) 동지에 의해 지원됩니다. SA는 워즈 워드 센터 – 건강 연구 주식회사 교내 박사 친목에 의해 지원됩니다. 이 작품은 NIH 보조금 HD061916과 GM082978에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Item | Company | Cat. # | Comments (optional) |
| OCT Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| 7x7x5 mm Base Molds | Fisherbrand | 22-363-552 | |
| ImmEdge Pen | Vector Labs | H-4000 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951 | |
| Edge Rite Blade | Thermo Scientific | 4280L | |
| Anti-Mouse CD11c-PE | eBioscience | 17-0114-82 | |
| Anti-Mouse CD45R/B220-APC | BD Pharmigen | 553092 | |
| Anti-Mouse CD3-FITC | BD Pharmigen | 561798 | |
| Anti-Mouse CD4-PE | BD Pharmigen | 553652 | |
| Anti- Mouse CD8-PE | BD Pharmigen | 553032 | |
| Anti-Mouse CD19-PercP | BioLegend | 115531 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red | Fisher Scientific | 14175-079 | |
| 70 μm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Spleen Dissociation Medium | Stem Cell Technologies | 7915 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-072 | |
| Fc Block | ATCC 2.4.G2 | HB-197 | Supes obtained from cell line 2.4.G2 |
| Curved Scissor | F.S.T | 14061-09 | |
| Cryostat | Leica | 3050S | |
| FACS Calibur | BD | ||
| Countess Cell Counter | Invitrogen | ||
| Hematoxylin | Richard Allan | 7211 | |
| Eosin | Richard Allan | 71304 | |
| Formalin | Starplex Scientific | 3661 | |
Table 1. Reagents and equipment used in this study. |
References
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