从小鼠派伊尔集合淋巴结中分离并免疫染色淋巴细胞与树突状细胞

摘要

人们对了解派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）中特定细胞亚群的免疫学功能日益关注，PPs 是肠道相关淋巴组织的主要诱导部位。本文概述了制备 PP 单细胞悬液用于流式细胞术分析以及制备 PP 冷冻切片用于免疫染色的并行实验方案。

摘要

派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）是肠相关淋巴组织（gut-associated lymphoid tissues, GALT）的重要组成部分，在肠道免疫监视和稳态维持中发挥核心作用。肠道腔内的颗粒性抗原和微生物持续被滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）中的PP M细胞取样，并转运至下方的树突状细胞（dendritic cells, DCs）、巨噬细胞和淋巴细胞构成的网络中。本文描述了小鼠PPs的两种实验方案：（i）将PPs解离为单细胞悬液并进行流式细胞术分析；（ii）制备冷冻切片用于免疫染色。对于流式细胞术，PPs通过机械法解离后，经70 μm细胞筛过滤，以获得不含上皮细胞和大块碎片的单细胞悬液。从20–25个PPs（来自四只小鼠）开始，这一快速且可重复的方法可得到一群细胞 >2.5 × 10⁶ 细胞与 >90%细胞活力。对于冷冻切片，新鲜分离的派伊尔结（Peyer's patches）需浸入最佳切割温度（OCT）包埋剂中，置于液氮中速冻，随后使用冷冻切片机进行切片。组织切片（5–12 μm）经空气干燥后，用丙酮或甲醇固定，再进行免疫标记。

引言

派尔集合淋巴结（Peyer's patches，PPs）是人类和小鼠小肠中遍布的、由有序排列的淋巴滤泡组成的肉眼可见的集合体。图1是启动针对饮食抗原、共生细菌、微生物病原体以及口服疫苗黏膜免疫应答的主要部位 ^1-4与其他外周淋巴组织（如肠系膜淋巴结）不同，派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches, PPs）缺乏输入淋巴管。因此，PPs中的适应性免疫应答是由来自肠腔的抗原所驱动的。肠腔抗原的取样由滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium, FAE）完成，FAE由肠上皮细胞和一类称为M细胞的抗原取样细胞共同组成。在FAE下方的上皮下穹隆区（sub-epithelial dome, SED），分布着树突状细胞（dendritic cells, DCs）的网络，其间混杂有巨噬细胞、B细胞和CD4⁺ T细胞。⁺ T细胞 ^5-9每个派伊尔集合淋巴结（PP）淋巴滤泡的核心是滤泡树突状细胞（FDCs）和富含B细胞的中央生发中心，其周围为富含T细胞的滤泡间区。PP对抗原的摄取可诱导产生IgA+ B细胞浆母细胞和CD4⁺ 效应细胞和记忆细胞定植于周围的固有层，为抵御多种黏膜病原体提供免疫保护。

解析与抗原取样、加工及呈递相关的复杂免疫事件在派伊尔集合淋巴结（PPs）中是一项艰巨的任务，考虑到PP细胞仅占肠黏膜中总淋巴细胞的极小部分。....

方案

动物饲养在常规的无特定病原体条件下，并完全遵循瓦兹沃思中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行处理。

1. 口服灌胃

1. （可选）使用22 G ×1.5英寸钝端饲喂针（Popper Scientific，New Hyde Park，NY）对选定的小鼠品系进行抗原或目标微生物的灌胃。每只小鼠的给药体积不应超过400 μl。

2. 用于流式细胞术的PP细胞分离

1. 根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南，通过 CO₂ 窒息法对小鼠实施安乐死。
2. 手术前用 70% 乙醇或碘伏清洁腹部。沿腹中线进行标准剖腹手术，从肋骨基底部约 1.5 cm 处开始，使用外科剪做一单个（1 cm）切口。暴露腹腔并识别盲肠。在回肠-盲肠交界处剪断末端小肠，并轻柔地完整取出肠道。在将肠道从腹腔取出时，注意不要过度拉伸肠组织。
3. 将小肠置于湿润的纸巾或 Kimwipe 上。用生理盐水轻轻润湿小肠，以防止组织脱水。在小肠对系膜侧肉眼识别各个派伊尔结（PP）（图 1）。通常，单只小鼠有 5 至 10 个可见的派伊尔结，从十二指肠（近端）到回肠（远端）均匀分布。平均而言，四只小鼠可获得 23 个派伊尔结。
4. 使用弯头外科剪，轻柔地切除各个派....

结果

对总胰岛细胞（PP细胞）的单分散悬浮液进行流式细胞术分析，可明确区分细胞样品质量的优劣。在细胞活力超过80%的良好制备样品中，绝大多数细胞表现出较高的前向散射（FSC），表明细胞体积较大，同时侧向散射（SSC）较低，表明细胞颗粒度较小（图2A）。在本实验中，我们还通过在室温下（而非冰上）进行胰岛细胞分离步骤，并在最后一步使用含1% FCS的PBS（而非PHEM缓冲液）孵育细胞，人为制备了“质量较差的细胞样品”。在这些质量较差的样品中，大多数细胞表现出低FSC和高SSC，且位于设定门控R1之外（图2B）。这些细胞可能正在经历凋亡和/或坏死。

图3展示了使用多达四种不同荧光染料偶联的单克隆抗体混合物，以区分派伊尔集合淋巴结（PP）单细胞悬液中的多种细胞类型。通过分化群（CD）标记物CD19和B220进行标记显示，B细胞约占门控PP细胞群体的60%（图3A）。通过CD3与CD4（图3B）或CD3与CD8（

讨论

本文提供了用于流式细胞术和功能分析的PP单细胞悬液制备，以及用于免疫染色的冷冻切片制备的平行实验方案。只要具备流式细胞仪和冷冻切片机，这两种方法均具有高度可重复性且易于实施。对于初次进行该实验的研究人员需特别指出，与脾脏相比，派伊尔结（PP）的总细胞得率相对较低。尽管如此，我们所描述的方案通常可从单只小鼠获得0.8–1.2 × 10⁶个总PP细胞。虽然可以扩大样本量，但我们通常不汇集超过20–25个PP，因为根据我们的经验，过度汇集会导致细胞聚集，且细胞得率（及活力）显著下降。另一方面，我们也不建议使用少于15个PP进行本实验方案，因为需要达到一定的细胞数量阈值，才能成功完成整个细胞分离流程。如果下游功能实验对细胞活力要求较高，我们建议取少量分离后的细胞进行碘化丙啶染色，以便更准确地从总PP细胞群体中圈定活细胞群。最后需要指出的是，若需对特定细胞亚群进行过继转移或in vitro分析，本方法同样适用于细胞分选应用。

用于冷冻切片的PP组织收集相对简单，但PP组织的实际切片过程可能具有挑战性。例如，必须确保PP组织在模具中正确摆放（即垂直于模具.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
OCT包埋剂	Tissue-Tek	4583
7x7x5 毫米底模	Fisherbrand	22-363-552
ImmEdge笔	Vector Labs	H-4000
Superfrost Plus 载玻片	赛默飞世尔科技	4951
Edge Rite 刀片	赛默飞世尔科技	4280L
抗小鼠 CD11c-PE	eBioscience	17-0114-82
抗小鼠 CD45R/B220-APC	BD Pharmigen	553092
抗小鼠 CD3-FITC	BD Pharmigen	561798
抗小鼠 CD4-PE	BD Pharmigen	553652
抗小鼠 CD8-PE	BD Pharmigen	553032
抗小鼠 CD19-PercP	BioLegend	115531
不含酚红的汉克平衡盐溶液（HBSS）	Fisher Scientific	14175-079
70 μm细胞滤筛	BD Falcon	352350
脾脏解离培养基	干细胞技术	7915
山羊血清	Invitrogen	16210-072
Fc阻断	ATCC 2.4.G2	HB-197	来自2.4.G2细胞系的上清液
弯头剪刀	F.S.T	14061-09
冷冻切片机	Leica	3050S
FACS Calibur	BD
Countess 细胞计数仪	Invitrogen
苏木精	Richard Allan	7211
伊红	Richard Allan	71304
甲醛	Starplex Scientific	3661
<强>表1. 本研究中使用的试剂与设备。