Mausmodelle für Graft Arteriosklerose

Summary

Wir beschreiben Protokolle für unseren Maus Transplantat arteriosclerois (GA)-Modelle, die unter Zwischenschaltung einer Maus Gefäßsegmentes beinhalten in einen Empfänger des gleichen Inzuchtstammes. Durch Rückkreuzen zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender kann das Modell beurteilen die Wirkung bestimmter Gene auf GA.

Abstract

Graft arteriosclerois (GA), auch genannt Transplantatvaskulopathie, ist eine pathologische Läsion, die über Monate bis Jahre in transplantierten Organen durch diffuse, umlaufende Stenose des gesamten Transplantat Gefäßbaum dadurch entwickelt. Die wichtigste Komponente ist die Pathogenese GA Proliferation von glatten Muskelzellen-ähnlichen Zellen in der Intima. Wenn ein menschlicher Koronararterien-Segment in die infra-renale Aorta von immundefizienten Mäusen eingefügt ist, könnten die Intimas in Reaktion auf adoptiv übertragen humanen T-Zellen allogen der Arterie Spender oder exogenen humanen IFN-γ in Abwesenheit von humanen T-Zellen. Werden erweitern Zwischenschaltung einer Maus Aorta von einem Stamm in eine andere Maus-Stamm Empfänger als Modell für chronischen Abstoßung bei Menschen beschränkt, da die akute zellvermittelte Abstoßungsreaktion in diesem Mausmodell vollständig eliminiert alle Spender stammenden vaskulären Zellen des Transplantates in zwei bis drei Wochen. Wir haben vor kurzem zwei neue m entwickeltOUSE Modelle, um diese Probleme zu umgehen. Das erste Modell beinhaltet Zwischenschaltung eines Schiffes Segment aus einer männlichen Maus in einen weiblichen Empfänger der gleichen Inzuchtstammes (C57BL/6J). Transplantat-Abstoßung in diesem Fall werden nur gegen Nebenhistokompatibilitätsantigene von dem Y-Chromosom (in der männlichen, nicht aber die weiblich) und der Abstoßungsreaktion dass ausreichend träge spenderabhängig abgeleitet glatten Muskelzellen für mehrere Wochen erhalten erfolgt kodiert ist. Das zweite Modell beinhaltet Anordnen einer Arterie Segment von einer Wildtyp-Maus C57BL/6J Spender in einen Wirt Maus des gleichen Stammes und Geschlechts, die den Rezeptor für fehlt IFN-γ durch Verabreichung gefolgt Maus IFN-γ (geliefert durch Infektion der Maus Leber mit einem adenoviralen Vektor. Es gibt keine Ablehnung in diesem Fall als Spender und Empfänger Mäuse des gleichen Stammes und Geschlecht, sondern Spender glatten Muskelzellen proliferieren als Reaktion auf die Zytokin während host-abgeleiteten Zellen fehlt Rezeptor fürdieses Zytokin, sind nicht mehr reagiert. Durch Rückkreuzung zusätzliche genetische Veränderungen in den Behälter Spender können beide Modelle verwendet werden, um die Wirkung von spezifischen Genen auf GA Verlauf zu beurteilen. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für unsere Maus GA-Modelle.

Introduction

Graft arteriosclerois (GA), die auch als Transplantatvaskulopathie, eine pathologische Läsion, die über Monate bis Jahre in transplantierten Organen, die durch diffuse umlaufende Stenose der gesamte Pfropfcopolymerisat Gefäßbaumes ^7, dadurch entwickelt. Frühe Stadien kann exzentrisch und fokale Stenosen, die mehr offensichtlich sind in den Arterien, also mehr ähnelt Stenosen in konventionellen Atherosklerose gesehen. Das Lumen Verlust der Transplantatgefäße Ergebnisse Intima Ausdehnung durch Infiltration von Wirts-T-Zellen und Makrophagen, insbesondere die Ansammlung von extrazellulärer Matrix und glatte Muskulatur-ähnlichen Zellen stammten aus Transplantat Host oder beide ^{5, 13, 19,} die unzureichend kompensiert wird durch äußere Gefäß Umbau. In Herz-Transplantate sind die meisten klinisch relevanten Veränderungen, die in den epikardialen und intramyokardialen Koronararterien. Letztlich wird GA der Herzkranzgefäße führen ischämischer Herzinsuffizienz. GA ist die Hauptursache für Herz-spät grachtern Verlust. Die Stenosen GA an den Nahtlinien zu stoppen, stark verwickelt den Host als Antwort auf Alloantigene Transplantat in der Pathogenese und uns dazu GA als eine Form der chronischen Abstoßung ³ einzuordnen. Jedoch können auch andere Formen der arteriellen Verletzung erhöhen das Risiko von GA, entweder durch die Erhöhung der Netto-Belastung durch Verletzungen oder durch Intensivierung und / oder Modulation der alloimmune Antwort. Die Endothelzellen (EC) Auskleidung der Arterien Transplantat wird in menschlichen GA erhalten, und die meisten oberflächlichen Regionen der Intima neben dem EG-Futter ist der Standort am stärksten von host-IFN-γ abgeleiteten-produzierende T-Zellen und Makrophagen infiltriert ^11; in Einige Patienten GA mit der Entwicklung von Donor-spezifische Alloantikörper, die Transplantat EC ¹⁶ aber die Gefäße binden zugeordnete zeigen wenig Beweise für die fibrinoid Nekrose, die charakteristisch für akute Antikörper-vermittelten Abstoßung ¹¹ ist.

Die wichtigste Komponente ist die GA PathogeneseProliferation von glatten Muskelzellen, wie Zellen in der Intima, wenn dieser Prozess arretiert werden kann, ist unwahrscheinlich, GA voran. Frühere Arbeiten aus unserer Gruppe hatten gezeigt, dass Intimas der menschlichen koronaren Segmente in der Infrarot-renalen Aorten von immungeschwächten Mäusen in Reaktion auf adoptiv übertragen humanen T-Zellen allogene der Arterie Spender und dass dieser Prozess erweitern zwischengeschaltet könnte durch Neutralisieren menschlichen gehemmt werden IFN- γ ^18. Weiterhin exogenen humanen IFN-γ könnte Intima (und medial) glatten Gefäßmuskelzellen (VSMC)-Proliferation in diesen arteriellen Grafts in Abwesenheit von humanen T-Zellen ^{15, 17.} (Es ist wichtig zu beachten, dass Mensch und Maus IFN-γ nicht überqueren Spezies auszuschließen indirekte Auswirkungen auf die Mäusewirt in diesem experimentellen System.) Diese humanisierten Mausmodellen haben den Vorteil, rekapituliert humanen T-Zell / vaskuläre Zell-Interaktionen und die Intima Läsionen weitgehend von menschlichen (zB Transplantat-derived) Zellen,wie in klinischen Proben beobachtet, aber nicht vollständig zusammenzufassen die klinische Situation, weil sie die Rolle der Host Makrophagen und möglicherweise anderen Zelltypen in organspenderelevante Läsionen beteiligt ignorieren. Eine herkömmliche Maus-Modell des Prozesses könnte theoretisch dieses Problem anzugehen, ergänzen die Grenzen des humanisierten Modell für einen vollständigen Immunsystem des Wirts und die Bereitstellung der zusätzliche Vorteil, dass die Kraft der Maus genetische Methoden angewendet werden, um Ga. Die beiden am häufigsten verwendeten Mausmodelle beinhalten heterotope Herztransplantation und orthotopen Transplantation ¹ Arterie. Die Läsionen, die in den Arterien heterotoper Herztransplantate entwickeln werden weitgehend von Wirtszellen, wahrscheinlich von Knochenmark Ursprungs, während Intimazellen der Arterien im menschlichen Herzen Transplantate überwiegend von Transplantat Ursprung ^{5, 13, 19.} Dies ist ein wesentlicher Unterschied, der führte uns zu alternativen Mausmodelle entwickeln hat. Zwischenschaltungeine Maus Aorta von einem Stamm in eine andere Maus-Stamm Empfänger ist noch geringer als Modell für chronischen Abstoßung bei Menschen, da das Zell-vermittelten akuten Abstoßungsreaktion in diesem Mausmodell vollständig eliminiert alle Spender stammenden vaskulären Zellen des Transplantates in zwei bis drei ¹⁹ Wochen. Demzufolge sind die nachfolgenden Änderungen in der dazwischen Gefäßsegment gesehen nur eine Antwort von Wirtszellen, die das Gefäß dezellularisierte Gerüst neu besiedelt haben, wodurch eine sehr artifactual Situation von begrenzter Bedeutung als Modell für die Veränderungen im Transplantat Schiffe, die in der Klinik auftreten. Wir haben vor kurzem zwei neue Mausmodelle entwickelt, um diese Probleme zu umgehen ^21. Das erste Modell beinhaltet Zwischenschaltung eines Schiffes Segment aus einer männlichen Maus in einen weiblichen Empfänger der gleichen Inzuchtstammes (C57BL/6J). Das zweite Modell beinhaltet Zwischenschaltung einer Arterie Ausschnitt aus einem Wildtyp C57BL/6J Maus Spender in einem Host-Maus des gleichen Stammes und Geschlechts, die rec fehlteptor für IFN-γ (IFN-&ggr; R-KO) durch die Verabreichung von Maus gefolgt IFN-γ (geliefert über Infektion der Leber der Maus mit einem adenoviralen Vektor. Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle und die Vorteile unserer Maus GA-Modelle.

Protocol

Maus und allogenen Transplantats syngene Transplantationsmodell Alle Tierversuche wurden von der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschüsse der Yale-Universität genehmigt. Für Allograft Modell wurden Segmente der Aorta von männlichen, 4-5 Wochen alten WT (C57BL/6J) oder IFN-&ggr; R-KO-Mäusen in der Bauchaorta der weiblichen Empfänger, 8-12 Wochen alten WT zwischengeschaltet mit eine End-to -Ende mikrochirurgischen Anastomosentechnik (siehe nächste für Details). …

Representative Results

Maus Allotransplantat Arteriosklerose (GA) ein: In diesem Modell wird ein männlichen Spenders Aorta in weibliche Empfänger transplantiert, so dass die Host-alloreaktive T-Zell-vermittelte Reaktionen induziert alloimmune gegen eine kleinere Y-Antigen (die männlich-spezifische Antigen Nebenhistokompatibilitäts HY) ausgedrückt auf das Transplantat 12 und wiederum T IFN-γ Antriebe VSMC Proliferation 20, wie in anderen Allografttransplantation Modelle 2 beobachtet, 6, 8-10 un…

Discussion

Die beschriebenen Protokolle werden auf der Maus GA-Modelle konzentriert. Die Verfahren können zu anderen Transplantat Transplantation Modelle herangezogen werden. Diese Modelle sind mit humanisierten Xenograft (dh menschlichen koronaren Segmente in der Infrarot-renalen Aorten von immungeschwächten Mäusen eingefügt) und akute Abstoßung Maus GA-Modell (dh eine Maus Aorta aus einer genetischen Belastung in eine andere genetische Belastung Empfänger). Unsere Maus beschriebenen Modelle sind für die …

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
C57BL/6J (H-2b)	Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)	000664	Donor (5 weeks) Recipient (8-12weeks)
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053	Storage Solution(50 mg/ml) Working Solution(5 mg/ml)
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Inc.	NADA# 139-236	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution(1 mg/ml)
Ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01	Storage Solution(100 mg/ml) Working Solution-oral (0.027 mg/ml)
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400	Storage Solution(1000 U/ml) Working Solution(100 U/ml)
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	CareFusion	AL4109
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10	To prepare the anesthetic
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Microscope	Leica	MZ95
Micro Scissors	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5693
Spring Scissors	F.S.T	15009-08	To transect the aorta of donor or recipient
Extra Narrow Scissors	F.S.T	14088-10
Needle Holder/Forceps	MICRINS	MI1542	To hold the needle
Fine Forceps	F.S.T	11254-20
Forceps	F.S.T	11251-35
Standard Pattern Forceps	F.S.T	11000-12
Forceps	F.S.T	13011-12
LANCASTER Eye Speculum	Zepf Medical Instruments	42-1209-07
Micro Vascular Clip	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-6472
Micro Clip Applying Forceps With Lock	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5440
Black Polyamide Monofilament Suture	AROSurgical Instruments Corporation	Cat #T4A10Q07	10-0 suture, Needle=70 microns
Black Monofilament Nylon Suture	Syneture (Covidien)	SN-1956	6-0 suture
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	Reorder No. 94442000
1 ml Syringe	BD	REF 309659
3 ml Syringe	BD	REF 309657
10 ml Syringe	BD	REF 309604
18G 1 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305196
25G 7/8, Hypodermic Needle	BD	REF 305124
27G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305109
30G 1/2, Hypodermic Needle	BD	REF 305106
Hearting Pad	Sunbeam	Z-1228-001
Trimmer	Wahl	9854-500
			Table 2. Specific reagents and equipment.