Micro-partículas Velocimetry Imagem para a velocidade Medidas de fluxos de sangue Micro Perfil
Summary
Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é utilizado para visualizar as imagens de micro partículas emparelhadas semeadas nos fluxos de sangue que são interligado para dar um perfil da velocidade precisa. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo, cada uma das quais tem aplicações clínicas, podem ser derivadas a partir destas medições.
Abstract
Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é usado para visualizar imagens pareadas de micro partículas semeadas nos fluxos sanguíneos. As imagens são interligado para dar um perfil de velocidade precisa. Um protocolo é apresentada para medições μPIV dos fluxos sanguíneos em microcanais. Na escala da microcirculação, o sangue não pode ser considerado como um fluido homogéneo, uma vez que é uma suspensão de partículas flexíveis suspensas no plasma, um fluido newtoniano. Taxa de cisalhamento, a velocidade máxima, a forma do perfil de velocidade e taxa de fluxo pode ser obtida a partir destas medições. Vários parâmetros de chave, tais como a profundidade de foco, a concentração de partículas, e a compatibilidade do sistema, são apresentados a fim de assegurar, dados úteis precisos, juntamente com exemplos e resultados representativos para vários hematócritos e as condições de escoamento.
Introduction
O corpo humano contém numerosos vasos com diâmetro inferior a 50 um, que são o principal local de permuta entre o sangue e tecidos. O estudo do fluxo de sangue nesses vasos representa um desafio considerável, devido tanto à escala das medições e as propriedades dos fluidos de sangue. Estas medições, incluindo o gradiente de pressão, o corte na parede e perfis de velocidade nas arteríolas e vénulas, são factores principais relacionados com as respostas fisiológicas. Há agora oportunidades sem precedentes para resolver esses desafios de medição, graças às novas técnicas experimentais no micro escala para estudar a microcirculação e resolver este problema multiescala.
Velocimetria de imagem de micro-partículas (μPIV) é uma técnica de visualização de fluxo baseado em partículas, que é utilizado para avaliar perfis de velocidade de fluxo sanguíneo em microcanais por meio de correlação cruzada. μPIV, desenvolvido pela primeira vez por Santiago et al., tem sido utilizado com hemorreologiaestudos desde Sugii et al., em 2001, utilizou a técnica para medir o fluxo de sangue em 100 mM tubos de vidro redondo 1,2. Diferentes abordagens para existir μPIV. Câmaras de alta velocidade pode ser utilizado para relacionar o movimento das células vermelhas do sangue (RBC), e as imagens por impulsos pode ser utilizado para relacionar o movimento das partículas de marcadores. Qualquer destas opções podem ser acoplados com um microscópio vertical ou invertida, dependendo da aplicação. Em ambos os casos, o resultado é um perfil de velocidade 2D. Outra abordagem é a utilização de um microscópio confocal para atingir perfis 2D e 3D. Este método tem sido aplicado para o sangue 3,4,5.
Micro escala PIV tem várias complicações, quando comparado com macro PIV. Em macro PIV os dados podem ser limitados a um único plano de luz através das folhas, mas a iluminação de volume micro escala é necessário. Volume de iluminação é um problema maior para a imagiologia de micro fluxos sanguíneos, como os próprios GVs são grandes em comparação com o channels, e utilizando os glóbulos vermelhos como os marcadores partículas conduz a uma profundidade de correlação (DOC), o que pode diminuir significativamente o rigor dos resultados de correlação cruzada de 6,7,8. Após Wereley et ai. (1998), o DOC para um canal de altura com 40 um RBC como marcadores é de 8,8 mM, enquanto que com um traçador de partícula de 1 um a DOC é de 6,7 mM. Esta diferença torna-se mais pronunciado quando se muda a altura do canal e ampliação. Além disso, os glóbulos vermelhos são opacas, e aumentando a densidade dos GVs no fluxo provoca dificuldades de imagem. Traçadores fluorescentes partículas, utilizadas pela primeira vez por Santiago et al. (1998), têm sido defendidos como uma ferramenta para diminuir a influência de partículas fora do foco, quando usando as partículas mais pequenas possíveis. Utilização de 1 um de diâmetro micropartículas fluorescência acoplado com um laser é uma abordagem que pode diminuir a profundidade de foco no problema de micro imagiologia fluxo sanguíneo 10. Existem várias opiniões atuais do estado de μPIV technology, cada um dos quais destaca a importância da μPIV para estudos de fluxo de sangue 11,12. Várias considerações importantes devem ser tidas em conta quando se utiliza μPIV de sangue. No nível micro, a escala da microcirculação, o sangue não pode ser considerado como um fluido homogéneo, uma vez que é uma suspensão de células flexíveis vermelhas do sangue (eritrócitos), as grandes células brancas do sangue, plaquetas e outras proteínas suspensas num fluido newtoniano (plasma) .
Os perfis de velocidade medidos aqui pode ser utilizado para medir certas características das micro-circulações sanguíneas. Os factores importantes na microhemorheology são a taxa de fluxo do sangue, a forma do perfil de velocidade, e a tensão de cisalhamento na parede do recipiente. Esta informação tem implicações clínicas, tal como a microcirculação é o local para a troca de nutrientes no corpo, e esta troca é dependente do cisalhamento. Existem vários estudos de revisão atuais sobre o estado da investigação na microcirculação, bem 13,14,15.
Apresentado aqui é um protocolo para medições μPIV dos fluxos sanguíneos em polidimetilsiloxano (PDMS) microcanais. Canais de PDMS foram fabricados em casa seguindo as fontes na seção 1 do protocolo. Amostras de sangue de suínos foram obtidos a partir de um matadouro credenciado e limpos seguindo seção 2 do protocolo. Todos os dados foram obtidos usando o sistema MITAS μPIV LaVision, conforme descrito na seção 3 do protocolo. A montagem é composto por um laser Nd: YAG (New Wave Research, EUA) e câmara CCD (imagem intensa, Lavision), controlada por uma unidade programável de disparo, um microscópio de fluorescência acoplado a um estágio movendo-se em três eixos, e um computador, para além de uma câmara de alta velocidade (Dalsa 1M150, Holanda) foi adicionado para a visualização dos próprios eritrócitos. Ambas as câmeras são conectadas a uma caixa de ótica 2 portas (Custom por Zeiss, Alemanha). Em típico medidas in vivo do fluxo de sangue, um microscópio vertical é usado para rastrear as hemácias domselves, enquanto que, na típica aplicações in vitro um microscópio invertido é usado para controlar as partículas de marcadores. Neste única dupla set-up, a caixa de óptica permite que ambos os traçadores de ser fotografada usando um microscópio invertido. O sangue foi introduzido nos microchips através de uma bomba de seringa de alta precisão (Nexus3000, Chemyx Inc., EUA). Um diagrama do sistema é mostrada na Figura 1, onde a parte de cima da figura representa a 140 mM por 40 mM canais rectangulares fabricadas de PDMS, e a porção inferior representa todo o sistema, incluindo ambas as câmaras, o laser, a bomba de seringa e do microscópio.
ΜPIV atual set-ups disponíveis, geralmente com software proprietário, incluem TSI, Dantec Dynamics, e LaVision. Algoritmos de correlação cruzada standard pode ser conseguido através de numerosas opções de software, incluindo o MATLAB. O software não é a chave, a compreensão de que as caixas de diálogo correspondem matematicamente servirá o usor muito melhor. Neste protocolo Davis, software proprietário da LaVision ou MATLAB são utilizados. O protocolo não é um software específico, mas as opções do menu pode estar em lugares diferentes, em diferentes pacotes de software.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando μPIV para medições de fluxo de sangue na escala da microcirculação pode dar insights sobre um grande número de processos de engenharia biomédica, mecânica e química relevantes. Alguns dos principais fatores para contabilizar são a densidade da RBC-se, a agregação e deformabilidade do RBC, agregação ou movimento das micro partículas fluorescentes, ea fixação da RBC nos canais. Todos estes podem ser explicados se as orientações gerais estabelecidas acima forem seguidas. Há uma lista de verifica?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a NSERC (Ciências Naturais e Conselho de Engenharia do Canadá) para financiamento, Catherine Pagiatikis por sua ajuda em corridas iniciais, Sura Abu-Mallouh e Frederick Fahim para testar o protocolo, Richard Prevost de LaVision, Inc para o suporte técnico, e Guy Cloutier, da Universidade de Montréal para o empréstimo da câmera de alta velocidade Dalsa.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| fluorescing micro particles | Microgenics/FisherSci | R900 | |
| glycerol (OPTIONAL) | Sigma Aldrich | G6279-500 ml | |
| microcentrifuge, i.e. CritSpin | FisherSci | 22-269-291 | |
| syringe, i.e. 50 μl Gastight | Hamilton | 80965 | |
| camera, i.e. Imager Intense, high speed | LaVision, Dalsa | Imager Intense | |
| microscope, i.e. MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| syringe pump, i.e. Nexus3000 | Chemyx, Inc. | Nexus-3000 | |
| flexible tubing, i.e. Tygon | FisherSci | 14-169-1A | |
| data processing software, i.e. DaVis | LaVision | DaVis | |
| centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F |
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