Assembleia da nucleosomal Arrays de recombinantes Núcleo Histones e Nucleosome Posicionamento DNA

Summary

Um método é apresentado para a reconstituição do modelo matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e de DNA em tandem repetido posicionamento nucleosome. Nós também descrevem como experimentos de velocidade de sedimentação na ultracentrífuga analítica, e microscopia de força atômica (AFM) são usados ​​para monitorar o grau de saturação disposição nucleosomal após a reconstituição.

Abstract

Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. Matrizes nucleossomais são obtidos de uma de duas maneiras: a purificação de fontes in vivo, ou a reconstituição in vitro a partir de histonas de núcleo e de ADN recombinante em tandem repetido posicionamento nucleossoma. O último método tem a vantagem de permitir a montagem de uma mais uniforme em termos de composição e matriz nucleossomal precisamente posicionado. Experiências de velocidade de sedimentação em a informação analítica rendimento ultracentrífuga sobre o tamanho ea forma das macromoléculas através da análise da velocidade à qual elas migram através de uma solução sob a força centrífuga. Esta técnica, juntamente com a microscopia de força atómica, podem ser usadas para controlo de qualidade, garantir que a maior parte dos moldes de ADN são saturados com nucleossomas após reconstituição. Aqui nós descrevemos os protocolos necessários para reconstituir quantidades de miligramas de comprimento e de composição dmatrizes nucleossomais efined adequados para estudos bioquímicos e biofísicos da estrutura e função da cromatina.

Introduction

Genomas eucarióticos não existir como DNA nu, mas sim são compactadas e organizada por proteínas ligadas. Estes complexos de ADN e de proteínas são conhecidos como cromatina. A unidade de repetição básica de cromatina é o nucleossoma. Um nucleossoma é constituído por octâmero histona e 146 pares de bases de ADN envolvida em torno da histona octâmero cerca de 1,6 vezes ^uma. O octâmero histona é composto por duas cópias de cada um dos H2A histonas centrais, H2B, H3, e H4. Octâmeros histonas centrais que são espaçadas repetitivamente ao longo de uma molécula de DNA são chamados de matrizes nucleossomais. A estrutura estendida de matrizes nucleossomais tem sido referido como a fibra de 10 nm ou as "pérolas num fio" estrutura e está presente in vitro sob condições de baixo teor de sal ^2. A fibra de 10 nm é capaz de condensar em estruturas de ordem superior através de compactação intra-array e / ou inter-array oligomerization ^2. Estas estruturas de ordem superior pode ser induzida na presença de sais,ou pode ser influenciada por meio da ligação de proteínas de arquitectura da cromatina para a matriz nucleossomal ^3,4. Os níveis de compactação da cromatina são inversamente correlacionada com a taxa de transcrição in vivo ^5,6. Uma pesquisa recente destaca a importância da organização estrutural de genomas em processos como a diferenciação, o desenvolvimento de câncer, e outros ^7,8. O uso de matrizes nucleossomais para estudar a estrutura e função da cromatina tornou-se generalizada. Aqui nós descrevemos um método para a montagem de matrizes nucleossomais de histonas centrais recombinantes e DNA posicionamento nucleosome.

Usando DNA recombinante com repetições em série de sequências de posicionamento nucleossomas permite a reconstituição de matrizes que contêm nucleossomas regularmente espaçados. Duas das seqüências de posicionamento mais populares são a seqüência do gene 5S rRNA eo "601" seqüência ^9,10. A sequência de 601 foi derivado de experiências de SELEX e more posiciona fortemente nucleossomos do que a seqüência 5S ^11. Por conseguinte, o comprimento do DNA adaptador das matrizes 601 é mais homogénea. DNA posicionamento nucleosome tandem repetido é obtido por filtração em gel ^4,12. Histonas recombinantes são purificados a partir de E. Coli sob condições de desnaturação ^13. O uso de histonas recombinantes permite controlar cuidadosamente a composição das histonas nucleossomais matrizes. Por exemplo, o núcleo histonas com mutações específicas ¹⁴ ou modificações pós-traducionais ^15,16 pode ser substituído por histonas centrais de tipo selvagem.

Experimentos de velocidade de sedimentação monitorar a taxa de sedimentação de macromoléculas em solução sob uma força centrífuga aplicada ^17. Este fornece informação sobre o tamanho e forma de macromoléculas numa amostra. Experimentos de velocidade de sedimentação são, portanto, uma ferramenta adequada para o estudo de soluções mudanças de estado em fibras de cromatinaestrutura devido à condensação da cromatina ^18. Importante, é primeiro necessário utilizar experiências de velocidade de sedimentação, como um passo de controlo de qualidade em nucleossomal reconstituição matriz. Se o DNA e nucleossomos não são combinados na proporção molar apropriado, os conjuntos podem ser sub-ou sobre-saturado com histonas do núcleo. Assim, a informação obtida a partir de experiências de velocidade de sedimentação é usado para garantir que o ADN está adequadamente saturada com nucleossomas. É importante a utilização de métodos alternativos para estimar a saturação de ADN com os nucleossomas, especialmente se a trabalhar com um molde de ADN anteriormente não caracterizada. Portanto, nós também descrevem um método para análise de matrizes nucleossomais usando microscopia de força atômica (AFM). AFM é uma técnica poderosa que permite a visualização dos efeitos de uma série de parâmetros, tais como o nível de saturação, o efeito da presença de variantes de histona ou os efeitos de _MgCl2 ^19,20. AFM também tem sido aplied para estudar a dinâmica nucleossomos usando tempo de imagem lapso ^21. In vitro montado nucleossomais matrizes 12-meros são particularmente passíveis de estudos de AFM, porque eles pertencem à faixa de tamanho certo para AFM ^22. No presente estudo, utilizamos AFM de matrizes nucleossomais como um controle de qualidade, bem como um meio de afirmar os dados da AUC ("ver para crer"). Além de simples visualização, AFM permite a medição de perfis de altura de amostras como uma métrica adicional.

Protocol

1. Assembléia dos recombinantes Núcleo Histones em octâmeros Justificativa: O primeiro passo para nucleosomal reconstituição matriz é preparar octâmeros histonas centrais nativas da liofilizados histonas centrais recombinantes. Proteínas histona são combinados em quantidades equimolares e montadas em octâmeros histonas por diálise das amostras de um tampão de desnaturação em tampão de redobragem. Purifica-se e liofiliza histonas centrais recombinantes (H2A, H2B, H3,…

Representative Results

Para ilustrar o protocolo que reconstituído matrizes nucleossomais recombinantes de histonas de núcleo de Xenopus e de ADN consistindo em 12 conjunto 207 repete pb da sequência de posicionamento 601 (601 207 x 12). O primeiro montado octâmeros nativas de histonas de núcleo liofilizados e, em seguida, purificado os octâmeros por FPLC usando uma coluna S200 (Figura 1A). Complexos maiores eluir mais cedo a partir da coluna S200. As histonas geralmente eluir nesta ordem: agregados …

Discussion

Matrizes nucleossomais modelo são uma ferramenta muito útil para o estudo in vitro da estrutura e função da cromatina. Por exemplo, eles têm sido amplamente utilizado para estudar o mecanismo da condensação de cromatina na fibra solução ^30-34, e tornou possível a obtenção de uma estrutura de raios-x de um tetranucleosome ^35. Mais recentemente, eles têm se mostrado útil para decifrar os efeitos estruturais de variantes de histonas núcleo específico, mutantes e modificações…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	A3648-100ML
6-8 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	21-152-5
HiLoad Superdex 200 16/60 Column	GE	17-1069-01
Vivaspin 50 kDa MWCO Centrifugal Concentrator	Sartorius	VS2031
12-14 kDa MWCO Dialysis Tubing	Fisher	08-667A
Illustra Sephacryl S-1000 Superfine	GE	17-0476-01
XL-A/I Analytical Ultracentrifuge	Beckman-Coulter