Photothrombotic虚：マウス脳卒中研究のための低侵襲かつ再現性の光化学皮質病変モデル

Summary

Photothrombosisは、再現性の高い方法で、興味のある分野での小よく区切り梗塞を誘発するための迅速、低侵襲技術です。これは、トランスジェニックマウスの脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。

Abstract

photothromboticストロークモデルは、以前に注入された光感受性色素の光活性化によって与えられた皮質領域内虚血性損傷を誘発することを目指しています。照明続いて、色素が活性化され、その後の血小板凝集し、最終的に局所血流の中断を決定する血栓の形成、を、内皮細胞膜の損傷成分という一重項酸素を生成する。当初は1977年にローゼンブラムとエルSabbanによって提案されたこの手法は、後のラット脳内で1985年にワトソンによって改良と現行モデルの基礎を設定されていた。また、トランスジェニックマウス系統の可用性の向上、さらにphotothrombosisモデルの関心を高めるために貢献した。簡潔には、感光性染料（ローズベンガル）が腹腔内注射し、血流に入る。冷光源によって照射されたときに、色素が活性化になると、ローカルの結果、血小板の活性化および血栓症、内皮損傷を誘発する血流の中断。光源は、再現可能かつ非侵襲的な方法で、任意の目的の皮質領域のターゲティングを可能開頭の必要がなく無傷の頭蓋骨に適用することができる。マウスはその後縫合と目を覚ますために許可されています。虚血性損傷の評価が迅速トリフェニルテトラゾリウムクロリド又はクレシルバイオレット染色によって達成することができる。この技術は、正確なセルの特性又は機能的研究のために非常に有利で小型化と十分に区切られた境界の梗塞を生成する。また、トランスジェニックマウスにおける脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。

Introduction

21世紀の初めには、虚血性脳卒中は、長期障害¹とストロークは、2004年²で約5,7万人が死亡を占めている死亡、世界中の第二の原因の第二の原因を表して壊滅的な疾患である。に入れ、多くの努力にもかかわらず、脳卒中後の機能回復を改善するために利用できる有効な治療法はまだありません。それらは虚血性障害の病態のモデル化を可能にし、in vivoで異なる神経保護戦略の有効性を試験するようにストロークの動物モデルが広くストローク研究の分野で使用されている。これらのモデルのほとんどは、他のモデルは、通常、特定の領域、モータと体性感覚野に小型の病変を研究するために開発されたのに対し、（一時的または恒久的に）中大脳動脈内の血流を遮断することによって広範な梗塞を誘発することを目指します。しかし、いくつかの要因は、ACを生成するために寄与することができる使用マウス系統を含む実験的な脳卒中の研究、の変動のertain度、すべての上に、研究に含まれており、動物の年齢や性別、技術は、虚血性損傷を誘発するために採用。後者の点に関しては、期間と侵襲手術（ つまり開頭術の必要性）だけでなく、確実に虚血性病変を誘発するために、オペレータに必要な外科的なスキルは、in vivo脳卒中研究で成功し、公平のための重要な決定要因である。

photothrombosisの概念は当初、1977年³ローゼンブラムとエルSabbanによって提案され、ワトソンらがラットの脳におけるそのアプリケーションによって有名になった1985年⁴技術が大幅に向上し、現在のモデル³の基礎を設定された^{– 6。} photothromboticアプローチは以前に血液系、WHに供給される光感受性色素の光活性化を介して皮質梗塞を誘発することを目的と光にさらされる地域では地元の血管血栓症におけるICH結果。循環色素が冷光源によって適切な波長で照射されるとき、それは順番に反応性の高い一重項酸素生成物を多量に生成した酸素分子にエネルギーを放出する。これらの酸素中間体は、血小板付着および凝集に、最終的に局所脳流れの中断^7を決定血栓の形成をもたらす、内皮細胞膜の過酸化を誘導する。

Photothrombosisは、それが普通の人間のストロークで発生しますが、光にさらされる分野での血流の選択的な中断、その結果より多くの表面的な血管に病変を誘発するような唯一の動脈を閉塞または破壊しない非正規虚血モデルである。この理由のため、このアプローチは、皮質可塑性の細胞および分子生物学的研究のために適切であり得る。この技術の主な利点は、実行のそのシンプルさに存在します。スクラブ2分;頭皮を剃るための1分;;定位固定装置に動物を配置し、3〜5分また、photothrombosisは簡単に20分待ち（麻酔のために3分を含む動物あたり約40分で行うことができ消毒液で頭皮、切開をし、頭蓋骨をきれいに、冷光ファイバを配置し、2〜4分;腹腔内拡散のために5分待ち、、ローズベンガル液を注入する1分、照明の15分、そして5分〜傷をきれいに）動物を縫合。さらに、全く手術専門知識は病変がそのまま頭蓋骨のシンプルな照明を通じて誘導されるように、この手法を実行するために必要ありません。古典的な動脈閉塞とは異なり、この方法では、照射されたゾーン内に軟膜と実質内微小血管閉塞の選択を決定しない側副血管の目標領域内に酸素を供給するために残っていないような病変間のばらつきを低減する。

その特定の性質にもかかわらず、photothrombotic被害株は不可欠なメカニズムは、脳行程で発生する。同様に、ヒト行程における動脈閉塞し、血小板凝集及び血栓の形成が照射領域⁷の血流の中断を決定する。同様に、このモデルはまた、中大脳動脈閉塞⁸のように本質的な炎症反応を共有しています。しかし、よくdelimitated境界、部分的に保存され代謝の領域に対応する半影ゾーンでは、photothrombotic病変の後に非常に低下したり、存在しないです。これは明確な境界線は、虚血性または無傷皮質領域内の細胞応答の研究を容易にすることができる。 Photothrombosisマウスモデルは、トランスジェニック動物の様々な研究のストロークに特に適している。確かにバイアス^9を引き起こす可能性が高い死亡率を報告した古典的なモデルはC57BL / 6マウス系統内の全株と長期研究に合わせることはできません。

Protocol

1。手術前 1.5mlチューブにローズベンガルを秤量し、15 mg / mlの最終濃度に達するまで無菌食塩水に溶解する。 0.2μmのフィルターを通して滅菌をフィルタリングして、最大2ヶ月、室温で暗所に保管してください。 オートクレーブですべての手術器具を殺菌する。手術領域は、手術を開始する前に、1時間未満で消毒されるべきである。 注入されるローズベンガルの投与量?…

Representative Results

このプロトコルは、すでに肉眼（ 図1A-1C）の皮質の解剖時に表示されている皮質病変を生成します。 photothrombotic病変組織がローズベンガルの光活性化を可能にするために十分に透明である浅と深い皮質層に発症。脳梗塞の程度の測定を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した後、新鮮な組織、あるいは、クレシルバイオレットによるトリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC…

Discussion

修正や代用

なぜなら562 nmでの吸収ピークから、濾過キセノンアークランプからの緑色光レーザーは、もともと感光ローズベンガルを照射するように選ばれた。レーザー媒介励起がまだrecently5を用いたが、それはまた、色素の励起^10,15を確実に冷光ランプに置き換えることができます。冷光光ファイバは、レーザー光源より操作しやすく、安価である。しかし、レー?…

Materials

MATERIAL NAME	COMPANY	CATALOGUE NUMBER
			Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
			Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made