El aislamiento, tratamiento y análisis de células gingivales murinos
Summary
Este estudio describe una técnica eficiente para aislar y procesar los tejidos gingivales de la cavidad oral del ratón con el fin de producir un cultivo de una sola célula. Las células resultantes pueden ser utilizados además para el análisis de citometría de flujo y los estudios moleculares.
Abstract
Hemos desarrollado una técnica para aislar y procesar precisamente tejido gingival murino para citometría de flujo y los estudios moleculares. La encía es un tejido único e importante para estudiar los mecanismos inmunes, ya que está implicado en la respuesta inmune del huésped contra la biopelícula oral que podría causar enfermedades periodontales. Por otra parte, la estrecha proximidad de la encía al tejido óseo alveolar también permite el estudio de la remodelación ósea en condiciones inflamatorias. Nuestro método produce gran cantidad de células inmunes que permite el análisis de incluso poblaciones de células raras, tales como las células de Langerhans y células T reguladoras como hemos demostrado previamente 1. El empleo de los ratones para estudiar las respuestas inmunes locales implicadas en la pérdida de hueso alveolar durante enfermedades periodontales es ventajoso debido a la disponibilidad de diversas herramientas inmunológicas y experimental. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y el acceso relativamente inconveniente para la encía murino, muchos estudios evitarse examen de thitejido crítico s. El método descrito en este trabajo podría facilitar el análisis gingival, los que podrán aumentar nuestro subestimando sobre el sistema inmune oral y su papel durante las enfermedades periodontales.
Introduction
Encía es el tejido blando que rodea la porción cervical de los dientes y cubre el proceso alveolar (Figura 1). La encía es un tipo de la mucosa masticatoria que se puede separar más a fondo en epitelio de la mucosa y tejido conectivo (también conocido como submucosa o lámina propia). La estructura anatómica de la encía y los dientes adyacentes permite que las bacterias residen y desarrollan la placa (biopelícula) que desafía continuamente el sistema inmune local. Como resultado, la respuesta inflamatoria se desarrolla en la encía, lo que en ciertas circunstancias se convierte en destructivo – una condición denominada enfermedades periodontales 2. Básicamente, patologías periodontales inducidas por placa se pueden dividir en la gingivitis y la periodontitis. Gingivitis representa una condición reversible de la respuesta inflamatoria local que se limita a la encía. La periodontitis, en el otro lado, es un proceso destructivo irreversible en la cual el aparato de inserción (hueso alveolar, periodontalligamento, cemento y encía) se destruye 3.
La encía se propuso servir a los sitios, tanto como efectores e inductivo en enfermedades periodontales 4. Los estudios en humanos han sugerido que, en respuesta a la placa dental, células efectoras inmunes y las moléculas se infiltraron en la encía o de salida 5-7 dinámicamente. Esta actividad ha demostrado desempeñar un papel importante en la destrucción periodontal 8,9. Considerando que los datos generados por los estudios proporcionaron información valiosa con respecto a este proceso patológico, que trabaja con tejidos humanos poseen importantes limitaciones éticas, técnicas y experimentales. El desarrollo de modelos experimentales animales experimentos de causa-efecto mediante el empleo de ratones transgénicos y en las intervenciones in vivo 10. Como resultado, nuestro conocimiento de los mecanismos implicados en la enfermedad periodontal aumentó considerablemente durante las últimas dos décadas. Aún así, debido a la complejidad de las enfermedades periodontales, hayun debate sobre la naturaleza de la respuesta inmune local para facilitar la destrucción del tejido. Hay también una falta en nuestra comprensión de la función de las células inmunes centrales en la encía durante enfermedades periodontales. Es por lo tanto esencial para estudiar eventos inflamatorios patológicos que se producen en el tejido diana de la enfermedad, la encía.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tejidos gingivales Maxilla obtenidos a partir de un solo ratón son suficientes para el análisis de subpoblaciones de linfocitos T y B, así como su capacidad para expresar moléculas extracelulares e intracelulares como hemos descrito anteriormente en 1. Sin embargo, si las poblaciones de células raras son de interés (por ejemplo, DC), se recomienda a los tejidos piscina 2-3 ratones. De nota, si así se prefiere, es posible despegar ambos los tejidos gingivales y palatales y luego a impuestos especiales, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por subvenciones de la Israel Science Foundation (No. 1418-1411) para AHH y (N º 1933/12) a AW, la Fundación Alemana de Israel para que los investigadores jóvenes (GIF joven) de AHH, y el Dr. I . Cabakoff Investigación Fondo de Dotación de la Escuela Hadassah de la Universidad de Medicina Dental de AHH y AW hebreo.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
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