Isolamento, elaborazione ed analisi dei murini gengivali
Summary
Questo studio descrive una tecnica efficiente per isolare e processare tessuti gengivali dalla cavità orale topo per produrre una coltura cella singola. Le cellule risultanti possono essere ulteriormente utilizzati per l'analisi di citometria a flusso e studi molecolari.
Abstract
Abbiamo sviluppato una tecnica per isolare e processare murino tessuto gengivale per la citometria a flusso e studi molecolari con precisione. La gengiva è un tessuto unico e importante per studiare i meccanismi immunitari perché è coinvolto nella risposta immunitaria contro i biofilm orale che potrebbe causare malattie parodontali. Inoltre, la vicinanza della gengiva al tessuto osseo alveolare consente anche studiando rimodellamento osseo in condizioni infiammatorie. Il nostro metodo consente di ottenere grandi quantità di cellule del sistema immunitario che permette l'analisi anche di popolazioni di cellule rare, come le cellule di Langerhans e le cellule T regolatorie, come abbiamo dimostrato in precedenza 1. Impiegando i topi per studiare le risposte immunitarie locali coinvolti nella perdita di osso alveolare durante la malattia parodontale è vantaggioso a causa della disponibilità di vari strumenti immunologici e sperimentali. Tuttavia, a causa della loro piccola dimensione e l'accesso relativamente scomodo per la gengiva murino, molti studi evitati esame di this tessuto critico. Il metodo descritto in questo lavoro potrebbe facilitare l'analisi gengivale, che si spera di aumentare la nostra sottovalutare sul sistema immunitario orale e il suo ruolo durante le malattie parodontali.
Introduction
Gengiva è il tessuto molle che circonda la porzione cervicale dei denti e copre il processo alveolare (Figura 1). La gengiva è un tipo di mucosa masticatoria che può essere ulteriormente separato in epitelio mucoso e tessuto connettivo (noto anche come sottomucosa o lamina propria). La struttura anatomica della gengiva e denti adiacenti permette ai batteri di risiedere e sviluppare placche (biofilm) che sfida costantemente il sistema immunitario locale. Come risultato, risposta infiammatoria sviluppa nella gengiva, che in talune circostanze diventa distruttiva – una condizione nota come malattie periodontali 2. In sostanza, patologie parodontali placca indotte possono essere suddivisi in gengivite e parodontite. La gengivite rappresenta una condizione reversibile della risposta infiammatoria locale che si limita alla gengiva. Periodontite, d'altra parte, è un processo distruttivo irreversibile in cui l'apparato di attacco (osso alveolare, parodontalelegamento, cemento e gengiva) è distrutto 3.
La gengiva è stato proposto per servire siti sia come effettori e induttivi durante malattie parodontali 4. Studi sull'uomo hanno suggerito che in risposta alla placca dentale, le cellule immunitarie effettrici e le molecole infiltrate o di partenza la gengiva 5-7 dinamicamente. Questa attività ha dimostrato di svolgere un ruolo importante nella distruzione parodontale 8,9. Considerando che i dati generati da questi studi hanno fornito informazioni importanti per quanto riguarda questo processo patologico, lavorando con i tessuti umani possiedono grandi limiti etici, tecnici e sperimentali. Lo sviluppo di modelli sperimentali animali sperimentazioni di causa-effetto con l'impiego topi transgenici e negli interventi in vivo 10. Come risultato, le nostre conoscenze sui meccanismi coinvolti nella malattia parodontale è aumentato notevolmente nel corso degli ultimi due decenni. Anche così, a causa della complessità delle malattie periodontali, c'èun dibattito in corso in merito alla natura della risposta immunitaria locale facilitando la distruzione dei tessuti. Vi è anche una mancanza nella nostra comprensione sulla funzione delle cellule immunitarie centrali nella gengiva durante malattie periodontali. E 'quindi essenziale studiare eventi infiammatori patologici che si verificano nel tessuto bersaglio della malattia, la gengiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Maxilla tessuti gengivali ottenuti da un singolo mouse sono sufficienti per analizzare sottopopolazioni di linfociti T e B, così come la loro capacità di esprimere molecole extracellulari ed intracellulari come noi descritta 1. Tuttavia, se le popolazioni di cellule rare sono di interesse (ad esempio DC), si raccomanda di tessuti piscina 2-3 topi. Di nota, se preferibile, è possibile sbucciare entrambi i tessuti palatali e gengivale e quindi di asportare la gengiva (una modifica del passo 1.8-1.9). Va rico…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal Israel Science Foundation (n. 1418/11) per AHH e (n. 1933/12) a AW, la Fondazione israeliana tedesco per i giovani ricercatori (GIF Young) di AHH, e la dottoressa mi . Cabakoff Research Fondo di dotazione presso la University-Hadassah School of Dental Medicine di AHH e AW ebraico.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
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