Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l'<em> Ex vivo</em> Human perfusion placentaire modèle
Summary
Le<em> Ex vivo</em> Modèle dual de la perfusion placentaire humaine recirculation peut être utilisée pour étudier le transfert des xénobiotiques et des nanoparticules à travers le placenta humain. Dans ce protocole vidéo, nous décrivons le matériel et les techniques nécessaires pour une exécution réussie d'une perfusion placentaire.
Abstract
Il ya le placenta humain décennies a été pensé pour être une barrière infranchissable entre la mère et l'enfant à naître. Cependant, la découverte d'anomalies congénitales induite par la thalidomide et de nombreuses études ultérieures ensuite prouvé le contraire. Aujourd'hui, plusieurs xénobiotiques nocifs comme la nicotine, l'héroïne, la méthadone ou de la drogue ainsi que des polluants environnementaux ont été décrits à surmonter cet obstacle. Avec l'utilisation croissante de la nanotechnologie, le placenta est susceptible d'entrer en contact avec de nouvelles nanoparticules soit accidentellement ou intentionnellement par l'exposition dans le cas des applications en nanomédecine potentiels. Les données de l'expérimentation animale ne peuvent être extrapolés à l'homme parce que le placenta est l'organe de mammifère spécifique à l'espèce la plus 1. Par conséquent, l'ex vivo double recirculation de perfusion placentaire humaine, développé par Panigel et al. 2 en 1967 et continuellement modifiée par Schneider et al., En 1972 3, peut servir comme un excellent modèle to étudier le transfert des xénobiotiques ou de particules.
Ici, nous nous concentrons sur la double ex vivo recirculation protocole de perfusion placentaire humaine et son développement ultérieur d'acquérir des résultats reproductibles.
Le placenta a été obtenu après consentement éclairé des mères issus de grossesses simples terme subissant une césarienne. Les vaisseaux du fœtus et de la mère d'un cotylédon intact ont été canules et perfusés au moins pendant cinq heures. En tant que particule de modèle de particules de polystyrène marquées par fluorescence avec des tailles de 80 et 500 nm de diamètre, ont été ajoutés au circuit maternelle. Les particules de 80 nm ont été capables de traverser la barrière placentaire et fournir un exemple parfait d'une substance qui est transférée à travers le placenta vers le foetus tandis que les particules de 500 nm ont été retenus dans le tissu placentaire ou circuit maternelle. Le modèle de la perfusion placentaire humain ex vivo est l'un des rares modèles fournissent des informations fiables surle comportement de transport des xénobiotiques à une barrière tissulaire importante qui fournit des données pertinentes prédictifs et clinique.
Introduction
Le placenta est un organe complexe qui est responsable de l'échange de l'oxygène, du dioxyde de carbone, des nutriments et des déchets, et en même temps en mesure de garder les deux circuits sanguins de la mère et le foetus croissant séparées l'une de l'autre. En outre, il évite le rejet de l'enfant par le système immunitaire de la mère et sécrète des hormones pour maintenir la grossesse. La barrière cellulaire est formée par les cellules du cytotrophoblaste qui fusionnent et forment un véritable syncytium sans membranes cellulaires latérales 4,5. L'ensemble du placenta est organisé en plusieurs cotylédons, qui contiennent un arbre villosités fœtales et représentent une unité fonctionnelle du placenta.
L'étude de la fonction de barrière placentaire a été intensifiée avec la découverte des malformations induites thalidomide dans les années 1960. Pour des raisons évidentes études de translocation avec les femmes enceintes ne peuvent pas être exécutées. Par conséquent, différents modèles alternatifs ont été développés 6,7 </splace>. Le modèle concerné plus prometteurs et probablement le plus clinique est le modèle ex vivo placenta humain de perfusion développé par Panigel et collègues 2,3.
Beaucoup de femmes sont exposées à des xénobiotiques tels que les médicaments ou les polluants de l'environnement au cours de leur grossesse 8. Pour certains médicaments qui ont déjà été administrées régulièrement pendant la grossesse, des études in vivo peut être réalisée par comparaison de la concentration sanguine maternelle avec celle de sang de cordon ombilical. Cependant, il n'y a généralement que des informations limitées sur la pharmacocinétique et-dynamique chez le fœtus et la tératogénicité de ces substances.
Par exemple opiacés comme l'héroïne facilement traverser la barrière placentaire et peut conduire à une restriction de croissance intra-utérine, accouchement prématuré ou un avortement spontané 9,10. Ainsi, en cas d'abstinence disparus pendant la grossesse un traitement de substitution à la méthadone est recommandée. L'exmodèle de perfusion placentaire humain in vivo a montré que le transfert de la méthadone dans la circulation foetale est négligeable 11, ce qui correspond bien au-à-maternelle rapport calculé sang de cordon de concentration de sang après l'accouchement 12.
La nanotechnologie est un domaine en pleine croissance notamment en médecine. Ainsi, sous le naturel fines (<2,5 m de diamètre) et les particules ultrafines (<0,1 m de diamètre) dans les fumées des feux de forêt, les éruptions volcaniques et dans la poussière du désert, l'exposition aux nanomatériaux manufacturés (au moins une dimension <0,1 um 13 ) est en augmentation. Cela a soulevé des questions sur le potentiel toxicologique des nanomatériaux manufacturés. Bien qu'aucun risque humain pourrait être encore prouvé, il ya des principales études expérimentales indiquent que les nanoparticules manufacturées peuvent provoquer des réactions biologiques néfastes conduisant à des résultats toxicologiques 14. Récemment, certaines études ont montré que l'exposition prénatale à l'la pollution de l'air est liée à un besoin respiratoire supérieur et de l'inflammation des voies respiratoires chez les nouveau-nés et d'enfants 15,16. En outre, les petites nanoparticules pourraient être utilisées comme vecteurs de médicaments pour traiter spécifiquement, soit le fœtus ou la mère. Par conséquent, il devient évident que des études approfondies des xénobiotiques ou des nanomatériaux distinctes et leur capacité à traverser la barrière placentaire sont nécessaires. Un aperçu réel sur les études en cours sur la perméabilité placentaire aux nanomatériaux manufacturés, est résumée dans Menezes et al. 2011 17 et Buerki-Thurnherr et al. 2012 7.
Le double ex vivo recirculation modèle de perfusion placentaire humaine fournit un système contrôlé et fiable pour étudier le transport placentaire de divers endogènes et exogènes composés 3,11,12,18,19 et un large éventail d'autres fonctions du placenta comme mécanismes responsables de l' développement d'états pathologiques comme la pré-éclampsie <sup> 20-22. Dans ce protocole, nous nous concentrons principalement sur la mise en place, la manipulation et un procédé qui permet l'étude de l'accumulation, les effets et les taux de translocation d'un large éventail de xénobiotiques ou des nanoparticules.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sous la perfusion double recirculation montré ici, il ya plusieurs autres configurations expérimentales possibles en fonction de la question à laquelle il faut répondre. Perfusions placentaires particulièrement ouverts sont couramment utilisés pour évaluer la clairance du médicament à concentration stationnaire 3. La perfusion de recirculation set-up peut être également appliqué à confirmer transport actif de substances endogènes ou exogènes. Par cette approche, la même concentration de xénob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu financièrement par la Fondation nationale suisse (PNR 64 programme, accorder aucune 4064-131232).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
| Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
| D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
| Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
| Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
| Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
| Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
| Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
| Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| EQUIPMENT | |||
| Water bath | VWR | 462-7001 | |
| Thermostat | IKA-Werke GmbH & Co. KG | 3164000 | |
| Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
| Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| Notebook | Hewlett Packard | ||
| Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
| Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
| Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
| Blunt cannulae (Ø 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm | VWR | 291-1212 | |
| Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
| Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| pH meter + electrode | VWR | 662-2779 |
References
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