קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em> לשעבר vivo</em> דגם זלוף שליה אנושי
Summary
<em> לשעבר vivo</em> מודל זלוף שליה אנושי הסירקולציה המחודשת כפול יכול לשמש כדי לחקור את העברת xenobiotics ו חלקיקים ברחבי שליית האדם. בפרוטוקול וידאו זה אנו מתארים את הציוד וטכניקות הנדרשות לביצוע מוצלח של זלוף שליה.
Abstract
לפני עשרות שנים שליית האדם נחשב מחסום בלתי חדיר בין האם והעובר. עם זאת, הגילוי של מומים מולדים-Induced תלידומיד ומחקרים רבים מאוחר יותר לאחר מכן הוכיח את ההפך. היום כמה xenobiotics מזיק כמו ניקוטין, הרואין, מתדון או תרופות, כמו גם מזהמים סביבתיים תואר להתגבר על המכשול הזה. עם השימוש הגובר של ננוטכנולוגיה, השלייה עשויה לבוא במגע עם חלקיקי רומן או בטעות או במכוון באמצעות חשיפה במקרה של יישומי nanomedical פוטנציאליים. נתונים מניסויים בבעלי החיים לא ניתן להסיק לבני אדם, כי השליה היא האיבר של היונקים מינים הספציפיים ביותר 1. לכן, vivo לשעבר זלוף שליה אנושי הסירקולציה המחודשת כפול, שפותח על ידי Panigel et al. בשינה 1967 2 ורציפות שונה על ידי שניידר ואח'. בשנת 1972 3, יכול לשמש כמודל לא מצויןo ללמוד את העברת xenobiotics או חלקיקים.
כאן, אנו מתמקדים כפול vivo לשעבר הסירקולציה המחודשת פרוטוקול זלוף שליה אנושי ופיתוח נוסף שלה לרכישת תוצאות לשחזור.
Placentae התקבלו לאחר הסכמה מדעת מהאמהות מהריונות טווח מסובכים שעברו לידה בניתוח קיסרית. כלי העובריים ואימהיים של טבורית השלמה היו cannulated וperfused לפחות במשך חמש שעות. כמודל חלקיקי חלקיקי פוליסטירן שכותרתו fluorescently עם גדלים של 80 ו -500 ננומטר בקוטר נוספו למעגל האימהי. ה -80 ננומטר החלקיקים הצליחו לחצות את מחסום השליה ולספק דוגמה מושלמת לחומר אשר מועבר על פני השליה לעובר ואילו 500 ננומטר החלקיקים נשמרו ברקמת השליה או מעגל אימהי. מודל זלוף השליה לשעבר vivo האנושי הוא אחד מכמה מודלים המספקים מידע אמין עלהתנהגות ההובלה של xenobiotics במחסום רקמה חשוב, אשר מספק נתונים רלוונטיים לניבוי וקליניים.
Introduction
השליה היא איבר מורכב האחראית על חילופי חמצן, פחמן דו חמצני, חומרים מזינים וחומרי פסולת ובו בזמן מסוגל לשמור על שני המעגלים של האם והעובר הגדל מופרד אחד מהשני בדם. בנוסף, הוא מונע דחייה של הילד על ידי מערכת החיסון האימהית ומפריש הורמונים כדי לשמור על הריון. המכשול הסלולרי נוצר על ידי תאי cytotrophoblast שהפתיל וליצור syncytium אמיתי בלי קרום תא לרוחב 4,5. כל השליה מאורגנת בכמה פסיגים, המכילים עץ אחד villous עוברי ומייצגים יחידה תפקודית אחת מהשליה.
המחקר של תפקוד מחסום השליה הוגבר עם הגילוי של מומים המושרה התלידומיד בשנתי ה -1960. מסיבות מובנות לא ניתן לבצע מחקרי טרנסלוקציה עם נשים בהריון. כתוצאה מכך, מודלים חלופיים שונים פותחו 6,7 </sעד>. המודל הרלוונטי המבטיח ביותר וכנראה הקליני ביותר הוא מודל vivo לשעבר אנושי השליה זלוף שפותח על ידי Panigel ועמיתים לעבודה 2,3.
נשים רבות נחשפות לxenobiotics שונה כגון תרופות או מזהמים סביבתיים במהלך ההריון שלהם 8. לחלק מתרופות שכבר מנוהלות באופן קבוע במהלך הריון, במחקרי vivo יכול להתבצע על ידי השוואה של ריכוז הדם האימהי עם זה בדם של חבל טבור. עם זאת, בדרך כלל יש מידע מוגבל בלבד על הפרמקוקינטיקה ו- דינמיקה בעובר וteratogenicity של חומרים אלה.
לדוגמא אופיאטים כמו הרואין לחצות בקלות את מחסום השליה ויכול להוביל להגבלת צמיחה תוך רחמי, לידה מוקדמת או הפלה ספונטנית 9,10. לכן, במקרה של התנזרות חסרה בזמן הריון טיפול בתחליפי מתדון עם מומלץ. לשעברמודל זלוף שליה אנושי vivo חשף כי העברת מתדון למחזור הדם של העובר היא 11 זניחים, שקושר היטב עם הדם האימהי ליחס מחושב דם טבורי הריכוז לאחר לידת 12.
הננוטכנולוגיה היא תחום צומח ובמיוחד בתחום הרפואה. לכן, באופן טבעי מתחת לקנס (<2.5 מיקרומטר קוטר) וחלקיקי ultrafine (<0.1 מיקרומטר קוטר) בעשן של שריפות יער, התפרצויות הרי געש ואבק במדבר, החשיפה לננו מהונדס (ממד אחד לפחות <0.1 מיקרומטר 13 ) הולך וגדל. זה העלה שאלות לגבי הפוטנציאל של ננו טוקסיקולוגי מהונדס. למרות שאין סכנה לבני אדם ניתן יהיה להוכיח זאת, יש מחקרים ניסיוניים עיקריים מצביעים על כך שחלקיקים מהונדסים יכולים לגרום לתגובות ביולוגיות שליליות מובילות לתוצאות toxicological 14. לאחרונה, חלק מהמחקרים מצביעים על כך שחשיפה טרום לידתי כדיזיהום אוויר קשור לצורך גבוה יותר בדרכי הנשימה ודלקת בדרכי נשימה בתינוקות ובילדים 15,16. בנוסף, חלקיקים קטנים עשויים לשמש כנשאים תרופות לטיפול או לעובר או לאם באופן ספציפי. לכן, הוא הופך להיות ברור כי מחקרים מקיפים של xenobiotics או ננו שונים וביכולתם לחצות את מחסום השליה נדרשים. סקירה בפועל על המחקרים השוטפים על חדירות שליה לננו המהונדסים מסוכמים במנזס et al. 2011 17 וBuerki-Thurnherr et al. 2012 7.
הכפול vivo לשעבר הסירקולציה המחודשת מודל זלוף שליה אנושי מספק מערכת מבוקרת ואמינה לחקר התחבורה השליה של אנדוגני השונים ותרכובות אקסוגניים 3,11,12,18,19 ומגוון רחב של פונקציות אחרות של השליה כמו מנגנונים אחראים ל התפתחות של מצבים פתולוגיים כמו רעלת הריון <sup> 20-22. בפרוטוקול זה אנו מתמקדים בעיקר להגדיר, טיפול ושיטה המאפשר מחקר של הצטברות, תופעות ושיעורי טרנסלוקציה של מערך רחב של xenobiotics או חלקיקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתחת לזלוף הסירקולציה המחודשת הכפול הראה כאן, ישנם מספר תצורות ניסיוניות אחרות אפשריות, תלויות בשאלה אשר צריכה להיות ענה. הזלפות שליה במיוחד פתוחות משמשות בדרך כלל כדי להעריך את אישור התרופה בריכוז המצב יציב 3. זלוף הסירקולציה המחודשת ההגדרה יכול להיות מיושם ג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת כלכלית על ידי הקרן הלאומית שוויצרי, (תכנית מפד"ל 64, אין להעניק 4064-131,232).
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| NCTC-135 medium | ICN Biomedicals, Inc. | 10-911-22C | could be replaced by Medium 199 from Sigma (M3769) |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Fluka | 71381 | |
| Potassium chloride (KCl) | Hospital pharmacy | also possible: Sigma (P9541) | |
| Monosodium phosphate (NaH2PO4 · H2O) | Merck | 106346 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4 · H2O) | Sigma-Aldrich, Fluka | 63139 | |
| Calcium chloride (CaCl, anhydrous) | Merck | 102388 | |
| D(+) Glucose (anhydrous) | Sigma-Aldrich, Fluka | 49138 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma-Aldrich | 31389 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Applichem | A1391 | |
| Amoxicilline (Clamoxyl) | GlaxoSmithKline AG | 2021101A | |
| Sodium heparin | B. Braun Medical AG | 3511014 | |
| Sodium hydoxide (NaOH) pellets | Merck | 106498 | CAUTION: corrosive |
| Ortho-phosphoric acid 85% (H3PO4) | Merck | 100573 | CAUTION: corrosive |
| Maternal gas mixture: 95% synthetic air, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Fetal gas mixture: 95% N2, 5% CO2 | PanGas AG | ||
| Antipyrine (N-methyl-14C) | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0108-50 μCi | CAUTION: radioactive material (specific activity: 55mCi/mmol) |
| Scintillation cocktail (IrgaSafe Plus) | Zinsser Analytic GmbH | 1003100 | |
| Polystyrene particles 80 nm | Polyscience, Inc. | 17150 | |
| Polystyrene particles 500 nm | Polyscience, Inc. | 17152 | |
| EQUIPMENT | |||
| Water bath | VWR | 462-7001 | |
| Thermostat | IKA-Werke GmbH & Co. KG | 3164000 | |
| Peristaltic pumps | Ismatec | ISM 833 | |
| Bubble traps (glass) | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Flow heater | UNI-GLAS Laborbedarf | ||
| Pressure sensor + Software for analyses | MSR Electronics GmbH | 145B5 | |
| Notebook | Hewlett Packard | ||
| Miniature gas exchange oxygenator | Living Systems Instrumentation | LSI-OXR | |
| Tygon Tube (ID: 1.6 mm; OD: 4.8 mm) | Ismatec | MF0028 | |
| Tubes for pumps (PharMed BPT; ID: 1.52 mm) | Ismatec | SC0744 | |
| Blunt cannulae (Ø 0.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.81 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.2 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.90 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.5 mm) | Polymed Medical Center | 03.592.94 | |
| Blunt cannulae (Ø 1.8 mm) | Polymed Medical Center | 03.952.82 | |
| Parafilm | VWR | 291-1212 | |
| Perfusion chamber with tissue holder (plexiglass) | Internal technical department | Similar equipment is available from Hemotek Limited, UK | |
| Surgical suture material (PremiCron) | B. Braun Medical AG | C0026005 | |
| Winged Needle Infusion Set (21G Butterfly) | Hospira, Inc. | ASN 2102 | |
| Multidirectional stopcock (Discofix C-3) | B. Braun Medical AG | 16494C | |
| Surgical scissors | B. Braun Medical AG | BC304R | |
| Dissecting scissors | B. Braun Medical AG | BC162R | |
| Needle holder | B. Braun Medical AG | BM200R | |
| Dissecting forceps | B. Braun Medical AG | BD215R | |
| Automated blood gas system | Radiometer Medical ApS | ABL800 FLEX | |
| Multi-mode microplate reader | BioTek | Synergy HT | |
| Liquid scintillation analyzer | GMI, Inc. | Packard Tri-Carb 2200 | |
| Scintillation tubes 5.5 ml | Zinsser Analytic GmbH | 3020001 | |
| Tissue Homogenizer | OMNI, Inc. | TH-220 | |
| pH meter + electrode | VWR | 662-2779 |
References
- Ala-Kokko, T. I., Myllynen, P., Vahakangas, K. Ex vivo perfusion of the human placental cotyledon: implications for anesthetic pharmacology. Int. J. Obstet. Anesth. 9, 26-38 (2000).
- Panigel, M., Pascaud, M., Brun, J. L. Radioangiographic study of circulation in the villi and intervillous space of isolated human placental cotyledon kept viable by perfusion. J. Physiol. (Paris). 59, 277 (1967).
- Schneider, H., Panigel, M., Dancis, J. Transfer across the perfused human placenta of antipyrine, sodium and leucine. Am. J. Obstet. Gynecol. 114, 822-828 (1972).
- Enders, A. C., Blankenship, T. N. Comparative placental structure. Adv. Drug Deliv. Rev. 38, 3-15 (1999).
- Takata, K., Hirano, H. Mechanism of glucose transport across the human and rat placental barrier: a review. Microsc. Res. Tech. 38, 145-152 (1997).
- Saunders, M. Transplacental transport of nanomaterials. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 671-684 (2009).
- Buerki-Thurnherr, T., von Mandach, U., Wick, P. Knocking at the door of the unborn child: engineered nanoparticles at the human placental barrier. Swiss Med. Wkly. 142, w13559 (2012).
- Gendron, M. P., Martin, B., Oraichi, D., Berard, A. Health care providers’ requests to Teratogen Information Services on medication use during pregnancy and lactation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 65, 523-531 (2009).
- Burns, L., Mattick, R. P., Lim, K., Wallace, C. Methadone in pregnancy: treatment retention and neonatal outcomes. Addiction. 102, 264-270 (2007).
- von Mandach, U. Drug use in pregnancy. Ther. Umsch. 62, 29-35 (2005).
- Malek, A., Obrist, C., Wenzinger, S., von Mandach, U. The impact of cocaine and heroin on the placental transfer of methadone. Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 61 (2009).
- Hutson, J. R., Garcia-Bournissen, F., Davis, A., Koren, G. The human placental perfusion model: a systematic review and development of a model to predict in vivo transfer of therapeutic drugs. Clin. Pharmacol. Ther. 90, 67-76 (2011).
- International Organization for Standardization (ISO). Technical Specification (ISO/TS) 27687. Nanotechnologies – Terminology and definitions for nano-objects – Nanoparticles, nanofibre and nanoplate. , (2008).
- Pietroiusti, A. Health implications of engineered nanomaterials. Nanoscale. 4, 1231-1247 (2012).
- Latzin, P., Roosli, M., Huss, A., Kuehni, C. E., Frey, U. Air pollution during pregnancy and lung function in newborns: a birth cohort study. Eur. Respir. J. 33, 594-603 (2009).
- Lacasana, M., Esplugues, A., Ballester, F. Exposure to ambient air pollution and prenatal and early childhood health effects. Eur. J. Epidemiol. 20, 183-199 (2005).
- Menezes, V., Malek, A., Keelan, J. A. Nanoparticulate drug delivery in pregnancy: placental passage and fetal exposure. Curr. Pharm. Biotechnol. 12, 731-742 (2011).
- Muhlemann, K., Menegus, M. A., Miller, R. K. Cytomegalovirus in the perfused human term placenta in vitro. Placenta. 16, 367-373 (1995).
- Wick, P., et al. Barrier capacity of human placenta for nanosized materials. Environ. Health Perspect. 118, 432-436 (2010).
- Dancis, J. Why perfuse the human placenta. Contrib Gynecol. Obstet. 13, 1-4 (1985).
- May, K., et al. Perfusion of human placenta with hemoglobin introduces preeclampsia-like injuries that are prevented by alpha1-microglobulin. Placenta. 32, 323-332 (2011).
- Guller, S., et al. Protein composition of microparticles shed from human placenta during placental perfusion: Potential role in angiogenesis and fibrinolysis in preeclampsia. Placenta. 32, 63-69 (2011).
- Challier, J. C. Criteria for evaluating perfusion experiments and presentation of results. Contrib. Gynecol. Obstet. 13, 32-39 (1985).
- Kraemer, J., Klein, J., Lubetsky, A., Koren, G. Perfusion studies of glyburide transfer across the human placenta: implications for fetal safety. Am. J. Obstet. Gynecol. 195, 270-274 (2006).
- leal, J. K., et al. Modification of fetal plasma amino acid composition by placental amino acid exchangers in vitro. J. Physiol. 582, 871-882 (2007).
- athiesen, L., et al. Quality assessment of a placental perfusion protocol. Reprod. Toxicol. 30, 138-146 (2010).
- Myllynen, P., et al. Preliminary interlaboratory comparison of the ex vivo dual human placental perfusion system. Reprod Toxicol. 30, 94-102 (2010).
- Malek, A., Sager, R., Schneider, H. Maternal-fetal transport of immunoglobulin G and its subclasses during the third trimester of human pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 32, 8-14 (1994).
- Prouillac, C., Lecoeur, S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. Dispos. 38, 1623-1635 (2010).
- Poulsen, M. S., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Modeling placental transport: correlation of in vitro BeWo cell permeability and ex vivo human placental perfusion. Toxicol. In Vitro. 23, 1380-1386 (2009).
- Mathiesen, L., Rytting, E., Mose, T., Knudsen, L. E. Transport of benzo[alpha]pyrene in the dually perfused human placenta perfusion model: effect of albumin in the perfusion medium. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 105, 181-187 (2009).
