Utilização de<em> In vivo</em> Imagem para monitorar a progressão da infecção pelo citomegalovírus Experimental Rato em recém-nascidos
Summary
O citomegalovírus (HCMV) A infecção humana de recém-nascidos representa uma importante causa de retardo mental, mas os eventos moleculares que levam à induzida por vírus patogênese ainda são pouco compreendidos. Para investigar a dinâmica da infecção cerebral, adaptamos todo-animais<em> In vivo</em> Imagiologia para realizar a análise tempo-curso de recém-nascidos infectados com um vírus recombinante luciferase.
Abstract
Citomegalovírus humano (HCMV ou HHV-5) é um agente patogénico de risco de vida em indivíduos imunocomprometidos. Após a infecção congênita ou neonatal, o vírus pode infectar e se replicar no cérebro em desenvolvimento, o que pode induzir a danos neurológicos graves, incluindo a surdez e retardo mental. Apesar do potencial de gravidade dos sintomas, as opções terapêuticas são limitados pela falta de uma vacina e a ausência de uma terapia antiviral específica. Por outro lado, uma descrição precisa dos acontecimentos moleculares que ocorrem durante a infecção do sistema nervoso central (SNC), uma vez que ainda falta observações principalmente derivam da autópsia de crianças infectadas. Vários modelos de animais, tais como macaco rhesus CMV, foram desenvolvidos e forneceu importantes insights patogénese CMV no SNC. No entanto, apesar da sua proximidade evolutiva com seres humanos, este modelo foi limitada pelo procedimento de inoculação intracraniana utilizada para infectar os animais e contrasistently induzir infecção do SNC. Além disso, considerações éticas têm promovido o desenvolvimento de modelos alternativos, entre os quais a infecção neonatal de ratos recém-nascidos com citomegalovírus rato (MCMV) foi recentemente levado a avanços significativos. Por exemplo, foi reportado que a injecção intraperitoneal de MCMV para Balb / c recém-nascidos resulta em infecção de neurónios e células gliais em áreas específicas do cérebro. Estas descobertas sugerem que a inoculação experimental de ratinhos pode recapitular os défices induzidos pela infecção por HCMV em crianças. No entanto, uma análise dinâmica de infecção MCMV de neonatos é difícil de realizar, porque metodologia clássica requer o sacrifício de um número significativo de animais em diferentes pontos de tempo para analisar a carga viral e / ou os parâmetros de auto-imunes. Para contornar esse obstáculo e permitir futuras investigações dos raros animais mutantes, foram aplicados in vivo tecnologia de imagem para realizar uma análise tempo-curso do viral difusão no cérebro após injecção periférica de um MCMV recombinante expressando a luciferase C57Bl / 6 neonatos.
Introduction
Citomegalovírus Humano (HCMV/HHV-5) é um membro da família β-herpesvírus. HCMV é altamente prevalente, patógeno oportunista que é geralmente adquirida durante a infância como uma infecção assintomática 1. Tal como todos os vírus de herpes, o HCMV persiste durante toda a vida do hospedeiro, cujo sistema imunitário bem controla a replicação viral. Episódios de reativação viral ocorrem principalmente em indivíduos imunocomprometidos, como pacientes transplantados que recebem medicamentos para evitar a rejeição do enxerto 2. Nos adultos, o HCMV também foi ligada a glioblastomas 3. Além disso, o HCMV é um patógeno importante para recém-nascidos com imunidade imaturo 4-6. A infecção primária no desenvolvimento do feto ou recém-nascido pode ter consequências graves. Infecção por HCMV é a causa infecciosa mais comum de defeitos congênitos e doenças da infância em países desenvolvidos. Estima-se que a incidência de infecção neonatal HCMV afecta 0,5-1% of todos os nascidos vivos, entre os quais 5-10% vão sofrer de sintomas graves, tais como microcefalia ou hipoplasia. Além disso, 10% das crianças infectadas com infecção viral subclínica, mais tarde, desenvolver sequelas levando a retardo mental, perda, defeitos visuais ou convulsão e epilepsia 7,8 audição.
Ao contrário de outros herpesvírus humanos, tais como herpes simplex 1 (HSV-1/HHV-1) que podem ser inoculadas aos ratos via diferentes vias de injecção 9, a replicação do citomegalovírus é específico da espécie. Este recurso investigações de HCMV patogênese que são realizadas em diferentes modelos animais severamente prejudicada (rato, porquinho da índia, macaco rhesus) e seus respectivos CMVs específica do host genuínos. Todos os CMVs apresentam semelhanças significativas no tamanho do genoma e organização, tropismo tecidual e regulação da expressão gênica. Eles também induzir patologias semelhantes nas suas respectivas hospedeiro. Apesar da diversidade genômica serinterpolação de HCMV e rato citomegalovírus (MCMV) (50% das ORFs presentes no vírus humano estão identificadas no CMV de murino), o modelo de rato demonstrou recentemente a ser vantajoso, principalmente porque as estirpes mutantes podem ser testados quanto à sua capacidade para controlar viral replicação in vivo. Isto levou a uma tela genética que permitiu uma estimativa do número de genes do rato expressos na fase adulta, que compõem a "resistome" para este vírus 10. No total, isto indica que os ratinhos infectados com MCMV representam um modelo atractivo para o estudo das interacções hospedeiro-vírus em adultos. A exploração de infecção congênita por CMV é mais complexa porque as diferenças na organização camada da placenta entre humanos e camundongos prejudicar a transmissão da mãe para o feto da infecção viral em camundongos. Recentemente, a injeção direta de MCMV na placenta no dia 12,5 de gestação permitiu infecção cerebral de ratos recém-nascidos que levaram à deterioração 11 de audição. No entanto, a maioria investigations agora usam injeção intraperitoneal de 4-20 neonatos hr de idade para proporcionar a disseminação viral sistêmica potencialmente levando à infecção cerebral hematogênica, um modelo que é mais relevante do que a de uma injeção intracraniana. Este protocolo fornecido conhecimentos importantes sobre patogénese CMV e, mais particularmente, foi demonstrado que a infecção MCMV de recém-nascidos resulta em replicação virai em células neuronais e gliais localizados nos focos inflamatórios, que são infiltrados com células mononucleares como macrófagos 12. Este relatório também descrito morfogénese alterada do cerebelo acompanhado com proliferação diminuída granular neuronal e da migração e indução de múltiplos genes do interferão-estimuladas. O papel essencial das células T CD8 + para o controlo de MCMV no sistema nervoso central também foi avaliado pelo mesmo grupo 13. Um aspecto importante a considerar quando se analisa o efeito patológico de um micróbio é a dinâmica do infectaríons. No caso do MCMV, é particularmente crucial para explorar e quantificar a progressão da disseminação do vírus no cérebro em desenvolvimento de modo a compreender e prever a magnitude das futuras lesões neurobiológicos. Tradicionalmente, a quantificação da progressão de uma infecção normal requer o sacrifício dos animais infectados titule o patógeno em tecidos, tais como o cérebro, que são de outro modo inacessíveis. Este tipo de protocolo é agora desafiado por necessária melhoria do bem-estar animal e os 3Rs (Reduzir, Refine, Replace) Princípios 14. Usando em tecnologias de imagem in vivo pode permitir uma redução drástica do número de animais que são necessárias em experiências de infecção in vivo. Aqui, vamos relatar e descrever a análise tempo-curso de disseminação viral para o cérebro sobre intraperitoneal MCMV-Luc injeção para recém-nascidos de rato. Usando os mesmos animais, nós rastreados e monitorizados in vivo os locais de intensa viral de replicação durante um período de 2 semanas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Usando a tecnologia de imagem vivo para monitorar MCMV-Luc disseminação de ratos recém-nascidos, pudemos observar propagação viral para o cérebro de animais mutantes, ao contrário do tipo selvagem. Além disso dissecação do animal e imagiologia ex vivo do cérebro confirmou a presença do vírus luminescente no sistema nervoso central. Além disso, também realizada imuno-histoquímica (não mostrado) em secções finas de cérebro com um anticorpo específico para a proteína E1 MCMV…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Lee Tuddenham (IBMC, em Estrasburgo) para amplificar e titulação MCMV-Luc e Thomas Baumert (INSERM U748, Estrasburgo) para permissão de uso do biotério do Instituto de Virologia. Apoio financeiro do INSERM, Université de Strasbourg ea Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) é reconhecido. A participação inicial de Sonia Beroud e Laetitia Lelieur durante seu projeto de Mestre também é reconhecido.
Materials
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylene blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer |
References
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