Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
A imuno-histoquímica (IHQ) fornece a visualização de proteínas altamente específico, confiável e atraente. execução correcta e a interpretação de um rotulagem multicolor baseado no IHC é difícil, especialmente quando utilizado para avaliar as inter-relações entre proteínas alvo no tecido com um elevado teor de gordura, tais como o sistema nervoso central (SNC).
Nosso protocolo representa um aperfeiçoamento da técnica de imunomarcação padrão particularmente adaptado para a detecção de ambas as proteínas estruturais e solúveis no rato SNC e nódulos linfáticos periféricos (LN) por neuroinflama�o afectadas. No entanto, com ou sem modificações adicionais, o nosso protocolo poderia provavelmente ser utilizados para a detecção de outros alvos de proteína relacionados, mesmo noutros órgãos e espécies que aqui apresentados.
Introduction
Apesar de a utilização de técnicas avançadas de alto rendimento análises realizadas na methylome, transcriptoma ou até mesmo nível de proteoma, imunocoloração continua sendo o padrão ouro para detecção de proteína directamente na amostra de tecido, cultura celular ou um esfregaço celular. Ao revelar o padrão de localização / distribuição, imuno-histoquímica (IHQ) pode avaliar proporções relativas e inter-relações topográficas das proteínas alvo, e até mesmo indicar as suas atividades biológicas. Portanto, IHC é amplamente utilizada para fins clínicos e de pesquisa, por exemplo, para o diagnóstico, avaliações de tratamento, estudo dos mecanismos da doença, alterações funcionais e fenotípicas em modelos animais, etc.
Compreendendo essencialmente histologia, patologia, bioquímica e imunologia, IHC tem avançado de forma significativa desde 1941, quando os anticorpos marcados com fluorescência foram utilizados pela primeira vez para identificar antigénios pneumocócicos no tecido infectado 1. Visualization de produtos e componentes celulares por IHC é baseada na ligação de anticorpos (Abs) para o seu antigénio específico (Ag). Além disso, utilizando anticorpos etiquetados fluoróforo, reacções imunes pode também ser visualizada usando enzimas como peroxidase ou fosfatase alcalina 2,3 4. Além disso, os anticorpos marcaram-ouro coloidal 5 são usados para detectar a interacção específica antigénio-anticorpo por luz e microscopia electrónica, enquanto marcadores radioactivos são visualizadas por autorradiografia.
A imuno Ag-Ab pode ser detectado através de métodos diretos e indiretos. O método directo é essencialmente mais simples e mais rápido, uma vez que utiliza directamente marcado Abs primária 6. No entanto, devido à falta de sensibilidade significativa, métodos indirectos são preferidos para os directos. Procedimentos de detecção indirecta duas etapas requerem unlabeled Abs primária, como o primeiro, e rotuladas Abs secundários dirigidos contra o Abs primário, como a segunda camada 7.amplificação do sinal pode ser conseguida com o envolvimento mais, de enzima acoplada terciária Ab (três passos método indirecto) que se liga ao Ab secundário. métodos de detecção comummente usados são indirectos avidina-biotina peroxidase-antiperoxidase e (PAP). Alternativamente, fosfatase alcalina fosfatase antialcalinos (APAAP) complexo pode ser usado em vez do método PAP. Notavelmente, fosfatase alcalina (AP) métodos parecem ser ainda mais sensível do que os métodos de imunoperoxidase 4. método de complexo avidina-biotina (ABC) utiliza Ab biotinilado secundário em combinação com avidina marcada com biotina complexo (LAB), ou estreptavidina marcada com biotina complexo (LAJE). A sensibilidade da detecção pode ser adicionalmente aumentada através do envolvimento de avidina marcada com peroxidase ou fosfatase alcalina 8. Outros métodos de detecção em uso são rotulagem polimérica, amplificação tiramina eo círculo 9 imuno-rolamento. Notavelmente, os diferentes métodos de detecção podem ser combinados para a detecção múltipla de Ag no mesmo tecidoamostra, que foi relatada pela primeira vez em 1978 4. imunomarcação dupla simultânea aqui apresentado foi realizado em fixado em formol e rato parafinado do SNC e LN cortes de tecidos utilizando anticorpos secundários ligados a peroxidase e AP-conjugados, respectivamente. Os sinais foram visualizados utilizando 3,3'-diaminobencidine cromogénio (DAB) e o Azul Rápido (FB) APAAP complexo, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
procedimentos IHC padrão muitas vezes exigem ajustes específicos para obter um ótimo resultado, que normalmente implica uma vasta experiência, mas também abordagem de "tentativa e erro". De preparação do tecido até visualização alvo, quase cada etapa do protocolo pode ser submetido a modificações concebidas individualmente, a fim de melhorar o resultado final. protocolo de coloração dupla aqui apresentado exemplifica proteínas na IHC visando particularmente ajustada para avaliar as inter-relaç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
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