Misura della tensione di uscita durante Laser Induced Axon Lesione di valutare Adesione assonale al substrato a piconewton e Millisecond Risoluzione
Summary
Abbiamo misurato il rilascio della tensione in un assone, parzialmente lesionati con un dissettore laser per la misurazione simultanea della spettroscopia di forza eseguita su una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell'assone. Il protocollo sperimentale sviluppato valuta l'assone adesione al substrato cultura.
Abstract
La formazione di connessioni funzionali in una rete neuronale sviluppo è influenzato da stimoli estrinseci. La crescita dei neuriti dei neuroni in via di sviluppo è oggetto di segnali chimici e meccanici, ed i meccanismi con cui percepisce e risponde a segnali meccanici sono poco conosciuti. Chiarire il ruolo di forze nella maturazione delle cellule consentirà la progettazione di scaffold che può promuovere l'adesione cellulare e citoscheletro accoppiamento al substrato, e quindi migliorare la capacità di diversi tipi neuronali di rigenerarsi dopo una lesione.
Qui, descriviamo un metodo per applicare misure di spettroscopia di forza simultanee durante laser della lesione cellulare indotta. Misuriamo il rilascio della tensione nel assone parzialmente lesionata dal simultaneo monitoraggio interferometrico di una sonda otticamente intrappolati aderito alla membrana dell'assone. Il nostro protocollo sperimentale rileva il rilascio della tensione con la sensibilità piconewton, e la dinamica del rilascio della tensione arisoluzione temporale millisecondo. Pertanto, offre un metodo ad alta risoluzione per studiare come l'accoppiamento meccanico tra cellule e substrati può essere modulata mediante trattamento farmacologico e / o da distinti proprietà meccaniche del substrato.
Introduction
Microscopia ottica è uno del sistema di imaging meno invasiva disposizione per osservare le cellule viventi. Con lo sfruttamento degli effetti, come la pressione di radiazione (come in pinzetta ottica 1), o flusso di fotoni ad alta energia (come nel laser dissettore 2), questa tecnologia è stata estesa a nano-manipolazione. Il sistema di imaging ottico fornisce un controllo preciso di visualizzare e manipolare gli obiettivi sub cellulari 3. Allo stesso tempo, grazie alla calibrazione accurata della potenza del laser consegnato, strumenti ottici realizzano sia la manipolazione del campione morbido o invasivi con riproducibilità senza precedenti.
Diversi laboratori integrati, nello stesso setup sperimentale, pinzette ottiche e laser dissettore per ablazione organelli 4, a fondere 5 celle diverse, o per stimolare le cellule dai guidato otticamente carichi 6,7. Mentre pinzette ottiche, dopo la calibrazione della rigidezza ottica, consentonoil controllo della forza applicata alla cella su scala piconewton, sistemi dissezione laser può modulare manipolazione ottica, che varia da membrana foto-porazione all'ablazione di singoli organelli o dissezione di strutture sub-cellulari. Tuttavia, calibratura dissezione laser si basa sulla valutazione qualitativa dell'entità di manipolazione ottica rispetto alla energia fornita al campione, principalmente sulla base di analisi di immagini che illustra i cambiamenti morfologici dovuti al campione 8. Nel metodo presentato, dimostriamo come eseguire la misurazione spettroscopia di forza durante la dissezione laser assonale di un neurone sviluppo, quantificare, su scala piconewton, la forza prodotta da un equilibrio alterato nella struttura citoscheletro di un compartimento subcellulare 9. Neuroni coltivati aderiscono al substrato, e polarizzano durante lo sviluppo. La fase di polarizzazione si verifica durante i primi cinque giorni in vitro. Alla seconda fase di polarizzazione, una delle estrusorizione neuriti diventa più lungo, e sarà differenziarsi per diventare l'assone 10. Allungamento assonale in risposta alla forza di traino presso il cono di crescita è già stato modellato dal modello di Dennerl 11. Recentemente, questo modello è stato esteso da 12 a includere il ruolo di neuriti adesione ai substrati della matrice extracellulare. Questo modello biofisico, proposto dopo 13 osservazioni sperimentali, ha mostrato che tirando forze sul cono di crescita, si propaga lungo i neuriti, sono modulati da adesioni focali al substrato. Allo stesso modo, lesione assonale produce un rilascio locale di tensione propagare verso il corpo cellulare. Pertanto, abbiamo proposto che la misura tale tensione rilasciato in una posizione lungo l'assone tra la lesione e la soma cellulare offre la possibilità di valutare l'esito di smorzamento di adesioni focali inalterati.
Calibriamo l'energia necessaria fotone-flusso del laser dissettore per controllare l'entità del damag assonale inflittoe, da completo transection a lesione parziale. Dopo la calibrazione, si è ripetuta lesione parziale ai assoni di diversi neuroni differenzianti e sviluppato il protocollo di quantificare il rilascio della tensione, e così ottenuto un parametro quantitativo per stimare l'adesione del assone al substrato 14.
Nel presente lavoro, si descrive in dettaglio il protocollo sviluppato, che rappresenta una precisa procedura sperimentale per valutare e confrontare con sensibilità piconewton assonale l'adesione al substrato in diverse condizioni sperimentali come trattamento chimico 14, o diversi tipi di supporto di coltura cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Riportiamo in questo lavoro un metodo quantitativo per confrontare l'adesione al substrato neuriti cultura, effettuando la misurazione simultanea forza spettroscopia laser durante lesione cellulare indotta. Il rilascio della tensione misurata è correlato al grado di adesione della cellula al substrato: celle con un numero più elevato di adesioni focali dovrebbero rilasciare meno tensione. Misurando il rilascio di tensione in termini di piconewtons fornisce una grandezza fisica da cui calcolare la assonale adesione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alberto Guiggiani per lo sviluppo del sistema di controllo in tempo reale, Evelina Chieregatti e Hanako Tsushima per penetranti discussioni, Giacomo Pruzzo e Alessandro Parodi per lo sviluppo di elettronica custom e software, e Claudia Chiabrera e Marina Nanni per la loro consulenza e assistenza nella preparazione della coltura cellulare esperto.
Materials
| REAGENTS | |||
| Polymer microspheres, Ø 4 μm, COOH coated | Bangs laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience | 19539 | |
| EQUIPMENT | |||
| IR laser | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization |
| Spatial light modulator | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Blue-tweezers software | Optics group, University of Glasgow | Free downloadable software | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | NIH | Free downloadable software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 with C5460SPL 6041 board | Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement |
| PD | Teem Photonics | PDA100A-EC | Photodiode to measure z trapped probe displacement |
| nano-Pulse UV laser | AA-optoelctronics | PNV-001525-040 | Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps |
| Acoustic Optic Modulator | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 nm fused silica | |
| Upright microscope | Andor | BX51 | Equipped with a 60X, 0.9 NA, water dipping objective |
| CCD | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Peltier device | Physic Instruments | QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller | |
| Microscope stage: micro+piezo stage | National Instruments | Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine | Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop |
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