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神经科学

長期増強の非常に安定しており、再現性録音のための改良された準備と海馬マウススライスの保全

Published: June 26, 2013
doi:
10.3791/50483
,
1Department of Neurosciences, Research Institute for Biosciences,University of Mons

Summary

本論文では、準備し、維持するために、完全な方法論を提示<em> in vitroで</em成体マウスから>急性海馬スライス。このプロトコルは95％の成功率を8時間より長く非常に安定した長期的な長期増強（LTP）の記録を可能にする。

Abstract

長期増強（LTP）は、シナプスの強さの増加によって特徴付けられるシナプス可塑性の一種であり、メモリ符号化に関与すると考え。 LTPは広く研究されている急性海馬スライスのCA1領域において誘発。しかしこの現象の維持段階の基礎となる分子メカニズムはまだよく理解されていない。これは、異なる研究室で使用されるさまざまな実験条件が一因である可能性があります。確かに、LTPの維持期は酸素、温度や湿度などの外部パラメータに強く依存する。また、解剖後にスライス平面、スライスの生存の向きなどの内部パラメータに依存しています。

すべてのこれらのパラメータの最適化は非常に再現性が非常に安定した長期増強の誘導を可能にします。この方法論は、さらに安定した増加に関与する分子メカニズムを探索するための可能性を提供しています海馬スライスにおけるシナプスの強さである。また、神経生理学的現象のin vitroでの調査での実験条件の重要性を強調しています。

Introduction

今日では、メモリは神経回路レベルで保存し、リコールされている方法の複合体の限られた理解があります。ただし、メモリ記憶の統一仮説が利用可能であり、広く受け入れられている。メモリは、中枢神経系のニューロン間のシナプス結合の強さの変化として記憶される。自分自身で、シナプス可塑性の研究は、主に2画期的な発見の恩恵を受けています。 （1）精実験、ブリスとロモ1では、そのまま麻酔ウサギを使用して、海馬のperforantパスを簡単に高周波数（1秒、100 Hz）での配信は刺激が長続きを引き起こしたことを（いくつかの発見時間）関連のシナプス結合の増加。この魅惑的な現象は、1975年2ダグラスとゴダードによって"長期増強"やLTPと呼ばれていました。 （2）その後、それは人為的にin vitroで生き維持同様の現象が、脳切片（0.6 mm）の中でトリガできることがわかった</eM>。最も広く研究さLTPは、いわゆるCA1領域の錐体ニューロンにおいて誘発生じる電界興奮性シナプス電位を記録しながら、軸索の束（いわゆるシェーファー側枝）に1つまたは複数の破傷風菌を提供することにより、 インビトロで観察された。 LTP誘導のメカニズムは、主に明らかにされている。 AMPA受容体のリン酸化（その効率を増加させる）と、シナプス後膜3に余分なAMPA受容体の組み込み：基本的には、NMDA受容体を介してCa 2 +の流入は、2つの結果を有する酵素を活性化する。対照的に、LTPの維持期のメカニズムは、30〜60分間、より多くの時間スライスのための健康を維持するために、実験的にはるかに困難であるため、特に、不明な点が多い。

研究の多くは、LTPのメカニズムの理解に専念してきており、興味深い理論が年間4-11にわたって詳述されている。しかし、国連ゴマ今、シナプス強度の安定した増加を根底に正確な分子メカニズムは解明されていない。これは、準備のためにさまざまなテクニックを使用して、異なる研究室で以前の結果を再現することが困難と海馬スライスの維持が一因である可能性があります。彼らの方法論の論文では、Sajikumar ら 12は、実験ラット海馬スライスの準備のための条件、安定したLTPの記録の重要性を強調した。このビデオでは、マウス海馬スライスでは非常に安定したLTPを記録することができるように長年にわたって我々の研究室で開発されたすべての最適化手順を提示します。

この最適化は、マウス13、ラット11 LTPのメカニズムを研究する他の研究室が開発し、正常に使用プロトコルから行われている。これは、経験豊富な研究者が成功率が高いと成体マウスでは非常に長期的なLTPを誘導し、記録することができます。 P誘発性LTPのhysiological基礎は慎重にチェックし、14を実証した。この方法論の論文では、解剖の手順が深くスライス興奮性を修正することができますが、温度や酸素のような実験条件のいずれかの変更は、LTPメンテナンスに多大な影響を及ぼす可能性があることを示している。また、すべてのこれらのパラメータの正確な制御が初心者の学生のために数ヶ月の訓練を必要とすることを強調しなければなりません。

Protocol

全ての動物の手順は、研究における動物のケアと使用のための衛生規制の国立研究所に合わせて、地元の倫理委員会の契約に行った。 1。人工脳脊髄液の調製同メディアは、解剖カットし、休息期間と電気生理学的記録中にスライス（1ml /分）灌流するために使用されます。このメディアは124のNaCl、4.4 mMのKClを、26 mMの炭酸水素ナトリウム、1mM…

Representative Results

この方法は、成体C57BL/6Jマウス（JANVIER SAS、フランス）14からの急性海馬スライスに誘起長期的な長期増強の特性を分析するために使用されている。驚くべきことに、実験条件の改善がLTPを見るための新しい方法につながっている。我々は、シナプス強度の長期的な増加は、新しいタンパク質の合成を必要としなかったことを示した。 ここでは、LTP誘導がスライス…

Discussion

我々は我々の研究室で開発され、LTP録音11,17に大きな専門知識を有する他の研究室で使用される方法の組み合わせに起因するプロトコルを開発した。このプロトコルは、成体マウスの海馬に適合され、どの年齢やバックグラウンド遺伝子型の動物において使用することができる。また、アルツハイマー病18,19のような神経変性疾患を開発するトランスジェニックマウスにおけ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は技術支援のためにバーナードFoucartに感謝します。この作品は、科学研究のためにベルギーの基金（FRS-FNRS）で医療研究のためのエリザベート王妃基金によってサポートされていました。アニエスヴィレは、科学研究のためにベルギーの基金で研究員です。

Materials

      Reagent/Material
NaCl Sigma – Aldrich S7653  
NaHCO3 Sigma – Aldrich S8875  
KCl Sigma – Aldrich P9333  
D-glucose Sigma – Aldrich G7528  
NaH2PO4 Sigma – Aldrich S9638  
MgSO4 1M Sigma – Aldrich 63126  
CaCl2 Sigma – Aldrich C4901  
Carbogen Air Liquide (Belgium)    
Capillaries WPI, Inc. (UK) TW150-4  
Stimulating Electrodes FHC (USA) CE2B30  
Surgical tools FST (Germany)    
Filter paper 84 g/m2 Sartorius FT-3-105-110  
Mesh Lycra 15 den  
Glue UHU plus endfest300  
      Instrument
Amplifier WPI, Inc. (UK) ISO-80  
Interface recording chamber FST (Germany)    
Peristaltic pumps Gilson (USA) Minipuls 3  
Temperature controller University of Edinburgh www.etcsystem.com  
Tissue Chopper Mcllwain    
Stimulators Grass (USA) S88X + SIU-V  
Program analysis WinLTP www.winltp.com  
Micromanipulators Narishige MM-3 and MMO-220A  
Surgical microscope Leica Microsystem    
A/D converter National Instruments NIPCI-6229 M-series  

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References

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Keywords: Hippocampal SlicesLong-term PotentiationLTPSynaptic PlasticityMemory EncodingCA1 RegionExperimental ConditionsOxygenationTemperatureHumiditySlice OrientationSlice ViabilityReproducibilityStable LTPMolecular MechanismsSynaptic Strength
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Villers, A., Ris, L. Improved Preparation and Preservation of Hippocampal Mouse Slices for a Very Stable and Reproducible Recording of Long-term Potentiation. J. Vis. Exp. (76), e50483, doi:10.3791/50483 (2013).
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