Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration
Summary
Intravitalmikroskopie der Maus M. cremaster Mikrozirkulation bietet eine einzigartige und in-vivo-Modell für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellen Migration gut standardisiert.
Abstract
In der Ära der intravaskulären Zellanwendungsprotokolle im Rahmen der regenerativen Zelltherapie, die zugrunde liegenden Mechanismen der Stammzellmigration, um Gewebe nonmarrow nicht vollständig geklärt. Wir beschreiben hier die Technik der Intravitalmikroskopie an der Maus Cremaster Mikrozirkulation für die Analyse von peripheren Knochenmark-Stammzellmigration in vivo angewendet. Intravitalmikroskopie des M. cremaster zuvor im Bereich der Entzündungsforschung für die direkte Beobachtung der Leukozyten-Wechselwirkung mit dem vaskulären Endothel eingeführt. Da eine ausreichende Umfangs Stamm-und Vorläuferzellmigration umfasst ähnliche anfänglichen Schritte entlang rollen und feste Haftung am Endothel es denkbar, den M. cremaster Modell für die Beobachtung und Quantifizierung der Wechselwirkung intravasculary verabreicht Stammzellen mit dem Endothel anzuwenden. Verschiedene chemische Komponenten selektiv an das Ziel t aufgetragen werdenProblem durch einfache Superfusionstechniken ist es möglich, wesentliche Voraussetzungen für die Mikroumgebungs ersten Stammzellrekrutierung, um in einem lebenden Organismus außerhalb des Knochenmarks nehmen zu etablieren.
Introduction
Der Zweck dieses Artikels ist es, die Technik der Intravitalmikroskopie (IVM) auf der Maus Cremaster Mikrozirkulation für die direkte Beobachtung und Analyse der peripheren Knochenmark-Stammzellen angewendet Migration zu beschreiben.
Das aktuelle Konzept der Stammzell Gewebe-und Organregeneration beinhaltet die Homing von Knochenmark-Stammzellen in die verletzte Gewebe ein. Ein entscheidender Schritt für eine erfolgreiche Stammzell-Migration beinhaltet die Stammzell Interaktion mit der lokalen Endothel innerhalb des verletzten Organ, gefolgt von transendotheliale Migration und schließlich Organ Transplantation 2. Intravital Analyse dieser Stammzellen – Endothelzell-Interaktionen bildet einen idealen Parameter für die Quantifizierung einer Stammzellregenerationsreaktion in verschiedenen pathophysiologischen Einstellungen in vivo. Ferner erscheint es denkbar, dass in der Zukunft, intravital Analyse der Migrationsfähigkeit spezifischer Stammzellen populations innerhalb der Mikrozirkulation standardisierten Umgebungen kann angewendet werden, bevor fort diese Bevölkerungs weitere klinische Tests.
Intravitalmikroskopie wurde ursprünglich für die Beobachtung und Quantifizierung der Leukozyten-Endothel-Zell-Wechselwirkung in vivo im Bereich der Entzündungsforschung 3 entwickelt. Erste erfolgreiche Aufnahmen von Intravitalmikroskopie Studien wurden von Cohnheim bereits im 19. Jahrhundert berichtet, Studium Froschzungen und Gekröse unter einem Lichtmikroskop 4. Seit seinem ersten Einsatz IVM hat eine enorme technische Entwicklung durchgemacht und ist heute bestimmte wesentliche Komponenten bilden Voraussetzungen, um quantitative IVM durchführen: (i) Gewebezubereitungen, die optischen Zugang zu ermöglichen, (ii) molekulare Sonden, die mit einem Mikroskop erkannt werden können, (iii ) ein Mikroskop, um ein Detektionssystem und (iv) Computer-basierte Analyse-Systeme, die interessierenden Parameter aus den Bilddaten zu extrahieren anschließbarSet 4.
Eine Vielzahl von Gewebepräparationen für IVM Studien einschließlich der Mesenterien und Leber der Maus und der Ratte 5, den Rückenhautkammern 6 der Maus und Hamster, Kaninchenohr und der Hamsterbackentasche ein paar zu nennen eingeführt.
Doch im folgenden werden wir auf der Maus Cremaster-Muskel, was eine ideale Gewebe für die Intravital Beobachtungen zu konzentrieren, als Vorbereitung und Visualisierung von einem gut standardisierten chirurgischen Eingriff möglich ist, und in der Regel keine Probleme von Bewegungsartefakten kommen. Die offene Cremaster-Muskel-Präparat wurde zum ersten Mal in den 1970er Jahren von Baez Kollegen und 7 durchgeführt. Ursprünglich für Ratten beschrieben, wurde auch erfolgreich auf die Maus 8 angenommen. Nach früheren Studien hatte vor allem auf Leukozyten-Interaktionen mit der Gefäßwand konzentriert, vor kurzem unsere eigene Gruppe die Maus Cremaster-Muskel-Präparat als BewertungsBLE Werkzeug für die direkte Visualisierung und quantitative Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen innerhalb einer definierten Mikro 9. Verschiedene Stammzellpopulationen untersucht die Verwendung dieses Modells, einschließlich murinen c-kit + Knochenmarkstammzellen und mesenchymale Stammzellen, sowie Menschen CD 133 + Knochenmarkstammzellen 10-12. Nach der Zellisolation aus Spender-Knochenmark-und Fluoreszenzmarkierung zur Anzeige, werden die Stammzellen selektiv in die Cremaster Mikrozirkulation unter Verwendung eines arteriellen Injektion über die Oberschenkelarterie eingesetzt, wodurch jede Zelle Einschließen in entfernte Organe vermieden. Darüber hinaus ist der Cremaster-Muskel-Modell besonders nützlich, da verschiedene Chemokine potenziell Vermittlung lokalen Stammzellmigration innerhalb der jeweiligen Einstellungen können lokal auf dem Zielgewebe durch einfache Superfusionstechnik angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravitalfluoreszenzmikroskopie ermöglicht die direkte Visualisierung und quantitative Analyse der Stammzell-Endothel-Interaktionen. Der Cremaster-Muskel-Modell ist besonders nützlich, da mikrochirurgischen Techniken Intravital Belichtung und Visualisierung haben sich etabliert in der Forschung auf Leukozyten-Endothel-Interaktionen und verschiedenen chemischen Komponenten können durch einfache Superfusionstechnik selektiv an das Zielgewebe angewendet werden. Aufgrund der Abwesenheit von Bewegungsartefakten und…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
References
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