İncelenmesi<em> Drosophila</emIşık Mikroskopi tarafından> Larva Trakeal Terminal Hücreleri
Summary
Burada, trakea terminali hücrelerinin ışık mikroskobu analizinde için bir yöntem mevcut<em> Drosophila</em> Larva. Bu yöntem, bütün hayvanlarda şube ve lümen morfolojisi hızlı incelenmesi için izin verir ve bireysel mutantlar veya terminal hücre gelişimi etkileyen mutasyonlar için ekranlar analizi için yararlı olacaktır.
Abstract
Hücre şekli hücre fonksiyonu için önemlidir. Ancak, hücre morfolojisi önemi rağmen, biraz tek tek hücrelerin belirli şekiller oluşturmak konusunda bilinmektedir. Drosophila trakea terminali hücreleri hücresel morfoloji üretmek için gerekli genlerin rolleri belirlemek ve aydınlatmak için güçlü bir genetik model haline gelmiştir. Terminal hücreleri, kollara ayrılmış boru şebekesinin bir parçası, iç dokulara oksijen sağlamak için işlevler, trakeal sistemi vardır. Terminal hücreler iki ayrı cep mimarileri sahip olarak hücre şekli soruları araştırmak için mükemmel bir model vardır. İlk olarak, Terminal hücreleri karmaşık nöron benzer ayrıntılı bir dallı morfolojisi, var, ikinci terminal hücre dalları ince tüpler olarak oluşan ve bir membrana bağlı hücre içi lümen içerirler. Terminal hücre şube sayısı, şube kuruluş ve bireysel şube şekli, kantitatif analiz belirli genetik mekanizma rolü hakkında bilgi vermek için kullanılabilirDallı bir hücrenin yapımında anisms. Bu hücrelerde tüp oluşumu analizi gibi omurgalı damar gibi diğer boru ağlara ortak tubulogenesis bir korunmuş mekanizmaları, ortaya çıkarabilir. Burada hızlı bir şekilde, görüntü düzeltmek için kullanılabilecek teknikler tarif ve Drosophila larvaları içinde hem dallanma desen ve terminal hücrelerde tüp oluşumu analiz. Bu teknikler, yabani tip ve mutant hayvanlar ya da genetik mozaik terminal hücreleri analiz etmek için kullanılabilir. Bu nedenle protokolün yüksek verimlilik, aynı zamanda iyi genetik, RNAi tabanlı veya Drosophila trakeal sisteminde ilaç ekranlar için uygundur.
Introduction
Hücre şekil bir organizma içinde, tek tek hücrelerin fonksiyonu için kritik yanı sıra hücreler, bir doku ya da organın bir parçası olarak işlev gördüğü. Dallanma ve tüp oluşumu (lumenogenesis): Biz hücresel morfoloji iki korunmuş tür kontrol katılmak moleküler mekanizmalarının araştırılması Drosophila trakeal terminali hücreleri, böcek solunum sisteminin bir bileşeni kullanın. Terminal hücreleri dallı tüpler bir ağın ucunda yer aldığını iç doku 1 oksijen teslim ve hedef dokularda 2 içinde yerel oksijen seviyesi ile kontrol edilir bir FGF sinyal yolu bağlıdır ayrıntılı bir dallı morfolojisi için çalışır. Terminal hücre dalları her şube ile çalışan gaz ile dolu bir hücre içi lümen ile, ince tüpler vardır. Genetik analiz Drosophila yapılabilir hangi kolaylığı ile birlikte terminali hücrelerin farklı hücresel mimarileri, bu hücreler, mükemmel bir model F yapmakya da, hücresel akıbet mekanizmaları araştıran dallanma, ve hücre içi tüp oluşumu. Terminal hücreleri dallı hücre farklılaşması, akıbet ve olgunlaşma 2-4 giden sinyal yollarının bazıları anlamak için yararlı bir model kanıtlamıştır. Bu sistem tarafsız kullanarak, hücre morfolojilerinden mutantlar için ileri genetik ekranlar hücre şekli 5,6 kontrol mekanizmaları içine anlayışlar verimli, yapılmıştır. Integrin-aracılı yapışma şube istikrar 8 için gerekli olduğunu,, örneğin, bu ekranlar belirli bir RabGAP lümen oluşumu ve konumlandırma 7 iskelet kutup ve vezikül ticareti için gerekli olduğunu ortaya koymuştur ve bu epitel PAR-kutup proteinler gerekli polarize membran ticareti düzenleyen dallanma ve lümen oluşumu 9 her ikisi için de. Terminal hücrelerinde Diğer çalışmalar, asimetrik aktin birikimi ve mikrotübül organizasyonu hücre uzaması ve lumenogenesis için gerekli olduğunu göstermiştir <s> 10 kadar. Böylece, farklı, korunmuş hücre biyolojik mekanizmaları terminali hücre morfolojilerinden katkıda bulunur.
Burada, biz hızla terminali hücre dallanma ve lümen oluşumu analizi için sağlam üçüncü evre Drosophila larvaları düzeltmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, aynı zamanda birinci ve ikinci instar hayvanlar üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin anahtarı genetik doğrudan sağlam hayvanların larva manikür floresan proteini ifade tarafından etiketli terminali hücreleri görselleştirmek için yeteneğidir. Bu işlem bu antikor boyama gibi sonrası tespit manipülasyonlar,, hücreleri gözlemlemek için gerekli olmadığından, iyi genetik ya da ilaç tarama dahil olmak üzere, yüksek verimlilik analizi için uygundur. Floresan proteini ifade sitoplazma dolu dalların yapı ortaya koymaktadır. Tüp oluşumu paralel çevreleyen sıvı-dolgu ile tezat gazlı lümen, tanımlamak için aydınlık mikroskobu kullanarak izlenebilired dokular.
Bu protokole dahil başka etiketlenmemiş hayvanlar floresan ile etiketlenmiş proteinleri homozigoz mutant terminali hücreleri üretmek için MARCM sistemi 11 esas genetik mozaik üretmek için bir yöntemdir. Terminal hücreler sadece nispeten geç gelişiminde onların kompleks yapıların ayrıntılı çünkü bu, gereklidir; genetik mozaikler önceki gelişiminde diğer dokularda gen gereksinimleri bypass için izin verir. . MARCM klon oluşturmak için, trakea burada tanımlanan nefes nefese trakeal-özel bir sürücü (btl) 12 kullanılarak etiketli Drosophila X kromozomu için protokoldür, diğer kromozomlar için, benzer bir prosedür olan kromozom uygun genetik reaktifler ile, kullanılabilir incelenmiştir. Burada, trakea bir sitoplazma lokalize GFP ifade etiketli, ancak prosedür gibi DsRed gibi diğer floresan proteinleri, ifade eşit derecede iyi çalışır.
Ayrıca, nöronal şube modelleri 13 tanımlamak için geliştirilen yöntemlere dayalı, Terminal hücrelerde dallanma desen ve lümen oluşumu ölçmek için bir yöntem dahil ettik. Nicel verilerin bu tür seçici kesin dallanma veya lumenogenesis sürecinde genlerin rolü, hem de farklı mutantlar 9 arasında doğrudan karşılaştırmalar için izin kritik olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan ısı sabitleme tekniği görüntüleme Drosophila larva trakeal terminali hücreleri için hızlı ve kullanışlı bir araçtır. Burada, dallanma ve yabani tip hücrelerin lümen desen incelemek için bu tekniği kullanın. Nefes nefese trakeal özel organizatörü tarafından tahrik GFP, ifade Trakeal hücreleri ısı sabitleme sonra larva manikür ile kolayca görüntülenebilir. Hem de hava dolu lümeninin gibi tek tek terminal hücreler, belirli bir desen dallanma hızlı bir …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz el yazması yapılan yorumlar için Gillian Stanfield teşekkür ederim. TAJ NIH NIGMS Utah Genetik Eğitim Grant T32-GM007464 Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Student Dumont #5 forceps | Fine Scientific Tools | 91150-20 | |
| Leica MZ16 Dissecting microscope (or equivalent) | Leica | MZ16 | |
| AxioImager M1 compound microscope (or equivalent) | Carl Zeiss | Equiped with AxioCam MRm, A-PLAN 10X/0.25, EC PLAN-NEOFLUAR20X/0.5, Filter Set 38HE | |
| 100% Glycerol | BioExpress | M152-4L | |
| Fly stock | Genotype: w FRT19A tub:GAL80 FLP122; Btl-GAL4, UAS-GFP y w FRT19A | ||
| Fly stock | Genotype: y w FRT19A |
References
- Manning, G., Krasnow, M. A. Development of the Drosophila Tracheal System. The Development of Drosophila melanogaster. , 609-685 (1993).
- Jarecki, J., Johnson, E., Krasnow, M. A. Oxygen regulation of airway branching in Drosophila is mediated by branchless FGF. Cell. 99 (2), 211-220 (1999).
- Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Social interactions among epithelial cells during tracheal branching morphogenesis. Nature. 441 (7094), 746-749 (2006).
- Ruiz, O. E., Nikolova, L. S., Metzstein, M. M. Drosophila Zpr1 (Zinc Finger Protein 1) Is Required Downstream of Both EGFR And FGFR Signaling in Tracheal Subcellular Lumen Formation. PLoS ONE. 7 (9), e45649 (2012).
- Ghabrial, A. S., Levi, B. P., Krasnow, M. A. A systematic screen for tube morphogenesis and branching genes in the Drosophila tracheal system. PLoS Genetics. 7 (7), e1002087 (2011).
- Baer, M. M., Bilstein, A., Leptin, M. A clonal genetic screen for mutants causing defects in larval tracheal morphogenesis in Drosophila. 遗传学. 176 (4), 2279-2291 (2007).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Whacked and Rab35 polarize dynein-motor-complex-dependent seamless tube growth. Nat. Cell Biol. 14 (4), 386-393 (2012).
- Levi, B. P., Ghabrial, A. S., Krasnow, M. A. Drosophila talin and integrin genes are required for maintenance of tracheal terminal branches and luminal organization. Development. 133 (12), 2383-2393 (2006).
- Jones, T. A., Metzstein, M. M. A novel function for the PAR complex in subcellular morphogenesis of tracheal terminal cells in Drosophila melanogaster. 遗传学. 189 (1), 153-164 (2011).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr. Biol. 20 (4), 359-366 (2010).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Shiga, Y., Tanaka-Matakatsu, M., Hayashi, S. A nuclear GFP/ß-galactosidase fusion protein as a marker for morphogenesis in living Drosophila. Dev. Growth Differ. 38, 99-106 (1996).
- Meijering, E., Jacob, M., Sarria, J. -. C. F., Steiner, P., Hirling, H., Unser, M. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Centanin, L., Dekanty, A., Romero, N., Irisarri, M., Gorr, T. A., Wappner, P. Cell autonomy of HIF effects in Drosophila: tracheal cells sense hypoxia and induce terminal branch sprouting. Dev. Cell. 14 (4), 547-558 (2008).
