הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

Summary

שיטת STA-PUT מאפשרת הפרדה של אוכלוסיות שונות של תאי spermatogenic בהתבסס על גודל וצפיפות.

Abstract

תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים. נכון לעכשיו, אין מערכת תרבית תאים אמינה המאפשרת בידול spermatogenic במבחנה, ורוב המחקרים ביולוגיים של תאי spermatogenic דורשים קציר רקמות ממודלים של בעלי חיים כמו העכבר והחולדה. בגלל האשך מכיל סוגים רבים של תאים – גם הלא spermatogenic (יידיג, Sertoli, מיאלואידית, ותאי אפיתל) וspermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, spermatids העגול, עיבוי spermatids ותאי זרע) – מחקרים של המנגנונים הביולוגיים המעורבים בתאי זרע דורש הבידוד והעשרה של תאים מסוגים שונים. שיטת STA-PUT מאפשרת להפרדת אוכלוסייה הטרוגנית של תאים – במקרה זה, מהאשכים – דרך שיפוע BSA ליניארי. סוגי תאים בודדים משקעים עם מהירות שקיעה שונה בהתאם לספירהגודל ll, והשברים מועשרים לתאים מסוגים שונים יכולים להיות שנאספו ומנוצלים בניתוחים נוספים. בעוד שיטת STA-PUT לא לגרום לשברים טהורים מאוד של סוגי תאים, למשל כמו ניתן להשיג עם שיטות מיון תא מסוימות, הוא מספק תשואה גבוהה בהרבה של תאים הכולל בכל שבריר
(~ 1 x 10 ⁸ תאים / סוג spermatogenic תא מאוכלוסייה התחלתי של 7-8 x 10 ⁸ תאים). שיטת תשואה גבוהה זה דורשת רק כלי זכוכית מתמחה ויכולה להתבצע בכל חדר קר או מקרר גדול, מה שהופך את שיטה אידיאלית למעבדות שיש להם גישה מוגבלת לציוד מיוחד כמו סדרן הקרינה הופעלה תאים (FACS) או elutriator.

Introduction

תאי זרע של יונקים הוא תהליך התמיינות מורכב המתרחש במספר שלבים בtubules seminiferous של האשכים ^1. בקצרה, הגזע דמוי spermatogonia שמתגורר בסמוך לאפיתל של מתרס אבובית seminiferous ולהתמיין לspermatocytes, אשר לאחר מכן יעבור חטיבות meiotic. לאחר מיוזה היא מוחלטת, וכתוצאה מכך התאים הפלואידים, או spermatids העגול, עוברים spermiogenesis, תהליך בידול המערב את שפיכת הציטופלסמה והדחיסה של הגרעין. Spermatids לפתח בהדרגה השוטון ועובר התארכות והתעבות של הגרעין, הפקת spermatids מתארך ולאחר מכן עיבוי, בהתאמה. מוצרי הקצה הם תאי זרע, המשתחררים ללומן של אבובית seminiferous וסופו של דבר ליותרת האשך שבו הם בוגרים יותר.

בגלל התהליך של spermatogenesis מסתמך על תנאים הורמונליים ומולקולריים מיוחדים בהאשכים, מערכת תרבות אמינה במבחנה לכל התהליך של תאי זרע עדיין לא פותחו ^2,3. שיטות תרבות פותחו ליצירה "תאי נבט קדמוני דמוי תא" ו "תאים עגולים כמו spermatid-" הפלואידים, מתאי גזע, אך שיטות אלה עדיין לא מסוגלים לייצר כמויות גדולות של תאים אלה ולא מצליחים לייצר תא spermatogenic מאוחר יותר סוגי ^4,5. למרבה המזל, סוגי spermatogenic התא שונים באופן משמעותי בגודלם, המאפשר להשעית תא בודד המתקבלת מכל אשכים להיות מופרדים עם שיפוע נוזלי. שיטת STA-PUT, הפגין כאן, משתמשת בשיפוע BSA ליניארי ושקיעה פשוט להפריד תאי spermatogenic מבוסס על גודל והמסה ^6-9.

יש שיטת STA-PUT מספר יתרונות על פני שתי שיטות נפוצות ביותר האחרות כדי להפריד בין סוגי spermatogenic תא: FACS וelutriation ^10-13. מנגנון STA-PUT דורש onlכמה חתיכות y של כלי זכוכית מתמחה התאספו בחדר קר או מקרר גדול. לכן, זה פחות יקר מאשר באמצעות סדרן תא או elutriator. שיטת STA-PUT מניבה כמויות גדולות יותר של תאים לכל סוג תא ואשך מאשר ניתן למיין על ידי FACS במסגרת זמן דומה, אם כי טוהר של כל אוכלוסיית תא הוא לא גבוה כמו אלו שהושגו עם ¹¹ FACS. מיון תא ניצול חרוזים מגנטיים (מיון מגנטי מופעל סלולרי, מחשבי מקינטוש) לאחרונה מועסק בהצלחה להעשרת spermatogonia מאוכלוסיית תאי אשכים מעורבת, אבל זה כרגע לא מתאים להפרדת spermatocytes או spermatids בשל חוסר ידע של שטח מתאים סמני ^14. יתרון נוסף של שיטת STA-PUT על FACS או MACS הוא היכולת לבודד תאי קיימא מתאימים לתרבות שלאחר מכן, כי, בניגוד לרוב פרוטוקולי FACS, היא אינה דורשת כל ה-DNA או סוגים אחרים של מכתים. למחקרים שדורשים lתשואות arge של סוגי תאי spermatogenic ב ~ טוהר 90%, STA-PUT היא שיטה אידיאלית.

Protocol

פרוטוקול STA-PUT כרוך בשלושה שלבים: 1) הגדרה של המנגנון וחומרים כימיים, 2) הכנה של השעיה תא מכל אשכים, ו3) טעינה סלולרי, שקיעה, ואיסוף שברים. כאשר היא מבוצעת על ידי צוות של שני חוקרים, הפרוטוקול לוקח שמונה שעות בממוצע. 1. הקמת מנגנון STA-PUT (אי?…

Representative Results

התוצאה האידיאלית מהליך STA-PUT היא הפרדה די בולטת של תאים מהאשכים המבוססים על גודל תא וצפיפות. בעוד התאים מבודדים מאשכי סדימנטציה דרך שיפוע BSA, כמה להקות שונות של תאים יכולות להיות שנצפו. כל גושים של תאים נוטים לשקוע בתחתית של השיפוע ולא לזהם את השברים האחרים. עוד קצת במע?…

Discussion

אלה שלומדים spermatogenesis להסתמך על מודלים של בעלי חיים לדגימות תאי spermatogenic, כמערכת תרבית תאים אמינה עדיין לא קיימת ליצירה כל סוגי תאי spermatogenic ^3. למרות שתאי spermatogenic נאספים בקלות מכל אשכים, רק אוכלוסיית תוצאות מעורבת. זה מהווה בעיה למי שרוצה ללמוד תתי סוגים מסוימים של ת?…

Materials

BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate can be used.
0.5%, 2%, and 4% BSA solutions	Dissolve 0.25 g, 11 g, and 22 g (respectively) in total volumes of 50 ml, 550 ml, and 550 ml of 1x KREBS (respectively).		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
KREBS (10x)	3.26 g KH2PO4 + 139.5 g NaCl +5.89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3.78 g CaCl2/2H20 + 7.12 g KCl, bring to 2 L with ddH20		Autoclave/filter and store at 4 °C for several months.
KREBS (1x)	Dissolve 4.24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20. Add 200 ml 10x KREBS. Bring to 2 L with ddH20.		To be made day of the STA-PUT procedure. Filter sterilize.
Collagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsin	Sigma	T9201-1G
DAPI	Preference of researcher
Triton-X100	Preference of researcher
Formaldehyde (~37%)	Preference of researcher
TABLE 2: EQUIPMENT
Equipment	Company	Catalog #	Comments
Complete STA-PUT apparatus	ProScience Glass Shop	STA-PUT (this procedure uses the standard sedimentation chamber: Cat. No. 56700-500)	Includes all glassware and equipment for the apparatus. Alternate glassware is available for performing STA-PUT with smaller cell numbers.
10 μm mesh filter	Fisherbrand	22363549
Mouse dissection tools	Preference of researcher
14 ml round bottom fraction collection tubes with caps	Preference of researcher
	Need approximately 100 tubes
Fraction collector	GE Healthcare Life Sciences	Model: Frac-920, Product code: 18-1177-40	Alternate can be used.
Microscope slides, cover glass	Preference of researcher
Light/Fluorescent Microscope	Preference of researcher