تلوين الأجسام المضادة في<em> C. ايليجانس</em> عن طريق "تجميد تكسير"
Summary
"تكسير الفريزر"، وهي طريقة لتعريض الأنسجة الداخلية للC. الخيطية ايليجانس إلى الأجسام المضادة للبروتين التعريب، ويتجلى.
Abstract
وصمة عار C. ايليجانس مع الأجسام المضادة، لا بد من تجاوزها بشرة منيعة نسبيا بالطرق الكيميائية أو الميكانيكية. "تكسير تجميد" هو أسلوب واحد يستخدم لسحب جسديا بشرة من الديدان الخيطية الديدان الخيطية عن طريق ضغط بين شريحتين ملتصقة، تجميدها، وسحب الشرائح على حدة. يوفر تجميد تكسير وسيلة بسيطة وسريعة للوصول إلى الأنسجة دون المعالجة الكيميائية، ويمكن استخدامها مع مجموعة متنوعة من مثبتات. ومع ذلك، فإنه يؤدي إلى فقدان العديد من العينات وضغط ميكانيكيا المطلوبة يشوه العينة. مطلوب الممارسة لتحقيق أقصى قدر من الانتعاش من العينات مع مورفولوجية جيدة. يمكن أن يكون الأمثل تجميد تكسير لشروط محددة التثبيت، والانتعاش من العينات، أو منخفضة تلطيخ غير محددة، ولكن ليس لجميع المعلمات في آن واحد. عن الأجسام المضادة التي تتطلب شروط التثبيت من الصعب جدا وتحمل العلاجات الكيميائية اللازمة لpermeabilize كيميائيا بشرة، المعاملهقد يكون من المفضل طن من الديدان الخيطية سليمة في الحل. إذا كانت الأجسام المضادة يتطلب الإصلاح أخف وزنا أو إذا كانت الشروط التثبيت الأمثل غير معروفة، ويوفر تجميد تكسير وسيلة مفيدة جدا لفحص الأجسام المضادة بسرعة ويمكن أن تسفر عن معلومات محددة توطين التحت خلوية والخلوية للمستضد من الفائدة.
Introduction
لتحديد توطين الخلوية والتحت خلوية من البروتينات، والعلماء وصفت تقليديا الأنسجة مع الأجسام المضادة المحددة للاعتراف على وجه التحديد خاصة البروتينات 1. في بعض الكائنات الحية مثل نموذج C. ايليجانس، وكثيرا ما تم استبدال تلوين الأجسام المضادة عن طريق التقنيات الوراثية الجزيئية، والتي تسفر عن نتائج بسرعة أكبر. وتشمل هذه الكائنات مع تحويل بنيات تتكون من اندماج الجينات بين المروج والمناطق الترميز من الجينات في المصالح وبروتين الفلورية الخضراء. ومع ذلك، والتقنيات الجزيئية تخضع لعدد من الأعمال الفنية، بما في ذلك المشاكل مع معرفة المروج الحقيقي والتغيرات في التعبير عن ثوابت في عدد نسخ عالية (التقنيات المعتادة في C. ايليجانس) 2،3. وبالتالي، وتلطيخ مع الأجسام المضادة لا تزال هدفا للعديد من العلماء دراسة وظيفة البروتين في الجسم الحي.
يمكن تلطيخ الأنسجة مع الأجسام المضادة يكون صعبا، إذ أنtibodies قد تعترف فقط المستضد خاصة في التشكل 1. على سبيل المثال، قد الأجسام المضادة تعترف فقط المستضد التشويه والتحريف أو سليمة ثابتة بطريقة معينة وقد لا تتعرف على المستضد في الموقع. وتتفاقم مشكلة تلوين الأجسام المضادة في الديدان الخيطية من حقيقة أن بشرة من الديدان الخيطية يشكل حاجزا غير منفذ نسبيا، ومنع وصول الأجسام المضادة للأنسجة.
هناك العديد من الطرق المختلفة المستخدمة لتلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس (إعادة النظر في عملنا السابقة 4). وصمة عار على حالها "الديدان"، وقد وضعت وسائل لتجميد وذوبان الجليد في تثبيتي الصعب نسبيا (الفورمالديهايد أو غلوتارالدهيد)، وتجميد أذاب دورات مساعدة للقضاء على بشرة للسماح الاختراق السريع من تثبيتي 5. بعد التثبيت، تم permeabilized بشرة للسماح الاختراق من الأجسام المضادة، وشملت أساليب العلاج مع الاختزال، كولاجيناز، أو كليهما 5-7. هذه رreatments الحفاظ على التشكل، ولكن في كثير من الأحيان انخفاض أو تدمير الاعتراف الأجسام المضادة. وتشمل الطرق البديلة تشريح 8 للسماح اختراق الأجسام المضادة.
"تكسير تجميد" هي طريقة واحدة للوصول إلى المناطق الداخلية من دودة شبه سليمة للسماح الضد تلطيخ 9-10. تجميد تكسير يمكن القيام بها مع مجموعة متنوعة من الظروف التثبيت مع تجنب العلاجات كولاجيناز والحد منها. يتم وضع الديدان الخيطية بين اثنين من المواد اللاصقة والشرائح، والمجمدة، ومن ثم يتم فصل الشرائح، وترك معظم الديدان الخيطية على الشريحة السفلي وجزء كبير من إهاب على الشريحة العليا. يمكن وضعها في أسفل الشريحة تثبيتي، ويتم نقل الشريحة بأكملها مع الديدان الخيطية الالتزام من خلال إجراءات تلوين الأجسام المضادة. طريقة يفعل الحاضر اثنين صعوبات كبيرة. الأولى، فإنه من الصعب تطبيق المبلغ الصحيح من الضغط اللازم لتقسيم النيماتودا دون تشويه جدية منهم. الثانية، فإن العديد من الديدان لا سوف قوضع علامة على أي شريحة، وسيتم فقدان في تثبيتي أو يشطف. ومع ذلك، مع الشرائح والممارسة السليمة، فإن طريقة تسفر بسرعة الديدان الخيطية مع التشكل معقولة والتي يمكن استخدامها مع مجموعة واسعة من مثبتات والأجسام المضادة.
طريقة قد تختلف قليلا، وهذا يتوقف على الهدف من المجرب. إذا كان المطلوب تلطيخ من الديدان الخيطية واحد (على سبيل المثال لتحديد ما إذا كان المحولة واحدة غيرت تلوين الأجسام المضادة)، ثم ينزلق مع التصاق القصوى (ولكن أعلى تلوين الخلفية) يمكن استخدامها، مثل الشرائح المعدة المختبر مع متعدد الليزين إضافية (انظر أدناه). لالفورمالديهايد أو غلوتارالدهيد التثبيت، أعلى الشرائح التصاق (شرائح متعدد الليزين، أعد المختبر) وينبغي أن تستخدم، منذ الديدان الخيطية التمسك أكثر قليلا للمتعدد الليزين بعد هذه التثبيتات. إذا كان يتم إصلاح البرية من نوع الديدان الخيطية مع الميثانول و / أو الأسيتون، ثم ينزلق مع انخفاض التصاق وينبغي أن تستخدم أقل تلوين الخلفية (تجارية أو لترaboratory-أعدت الشرائح). إذا كان يتم استخدام مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة ومثبتات في المختبر، ومجموعة مختارة من الشرائح قد يكون مستعدا في وقت مبكر وتخزينها لحين الحاجة إليها.
بعد أن تم تمكنت من الوصول إلى أنسجة الديدان الخيطية والإجراءات تلوين الأجسام المضادة اتباع الأساليب القياسية (مع حضانات يعد سمة من سمات الأنسجة بدلا من الخلايا 1،11).
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول تكسير تجميد هي واحدة من عدة طرق لتلوين الأجسام المضادة في C. ايليجانس. وهو يوفر وسيلة بسيطة نسبيا وصمة عار الديدان، ولكن لا تتطلب الكواشف محددة وممارسة لأفضل النتائج. الخطوات الحاسمة (المبين في الشكل 1) ما يلي: 1) إعداد الشريحة (انظر الخطوات 1 و 2) ض?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم توفير التمويل من قبل جبهة الخلاص الوطني CCLI # 0633618 وجامعة ولاية أوهايو. وقدمت بعض سلالات من مركز علم الوراثة انواع معينة. يظهر طالب دراسات عليا Reetobrata باسو في الفيديو.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| poly-L-lysine slide (ESCO brand) | Fisher | 12-545-78 | Sigma brand slides also suitable |
| poly-L-lysine hydrobromide | Sigma | P1524 | IMPORTANT: Brand and high molecular weight of polylysine critical |
| single frosted edge slides | Fisher | 48312-002 | Other brands are suitable |
| sodium azide | Sigma | S2002-25G | TOXIC, wear gloves and mask while weighing out powder to make 10% stock. Wear gloves when pipeting stock solution |
| coplin staining jar | VWR | 47751-792 | Other brands are suitable |
| 5-slide mailer | Electron Microscopy Science | 71549-01 | One of many different brands of small slide holder, suitable for staining |
| Paraformaldehyde | VWR | MK262159 | IMPORTANT: Regular formalin solutions (37% formaldehyde) are NOT suitable. Either 1) Dissolve crysatlaline paraformaldehyde in phosphate buffer and store in small aliquots frozen. Or 2) buy electron microscopy grade paraformaldehyde in aliquots. TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Glutaraldehyde solution, 25% in water | Sigma | G 5882 | IMPORTANT: purchase electron microscopy grade glutaraldehyde in ampules; TOXIC -wear gloves; dispose of excess down sink with water. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Other brands are suitable |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | Other brands are suitable |
| Donkey Serum, lyophilized | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Other brands are suitable |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG multi-labeling | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | This company is recommended for high quality multi-label (affinity depleted) antibodies. Select appropriate dye and antigen (animal used to raise primary antibody). |
| n-propyl gallate | Fisher | ICN10274750 | Other brands are suitable |
| DAPI, 4′,6′-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | D 9542 | TOXIC. Wear gloves and dispense into small aliquots and feeze to minimize exposure |
| Whatman #1 15 cm diameter filters | Fisher | 09805G | |
| Coverslip #1 1/2 rectangle 24 x 60 mm | VWR | 48393-252 | #1 1/2 thickness is optically best |
| Microscope slide folder | VWR | 48429-092 | Other brands are suitable |
References
- Harlow, E., Lane, D. . Antibodies: A Laboratory Manual. , (1988).
- Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. WormBook. , (2006).
- Duerr, J. S. Immunohistochemistry. WormBook. , (2006).
- Finney, M., Ruvkun, G. The unc-86 gene product couples cell lineage and cell identity in C. elegans. Cell. 63, 895-905 (1990).
- Garriga, G., Desai, C., Horvitz, H. R. Cell interactions control the direction of outgrowth, branching and fasciculation of the HSN axons of Caenorhabditis elegans. Development. 117, 1071-1087 (1993).
- Miller, D. M., Shakes, D. C., Epstein, H. F., Shakes, D. C. Immunofluorescence microscopy. Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism. , 365-394 (1995).
- Crittenden, S. L., Troemel, E. R., Evans, T. C., Kimble, J. GLP-1 is localized to the mitotic region of the C. elegans germ line. Development. 120, 2901-2911 (1994).
- Strome, S., Wood, W. B. Immunofluorescence visualization of germ-line-specific cytoplasmic granules in embryos, larvae, and adults of Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 1558-1562 (1982).
- Albertson, D. G. Formation of the first cleavage spindle in nematode embryos. Dev. Biol. 101, 61-72 (1984).
- Harlow, E. . Using Antibodies: A Laboratory Manual. , (1999).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. WormBook. , (2006).
