지방 조직 면역 세포의 분리
Summary
지방 조직 (AT)는 강력한 면역 세포 활성화와 상호 작용의 사이트입니다. 면역 시스템의 거의 모든 세포는 AT의 존재와 그 비율은 비만에 의해 변경됩니다. 면역 세포 인구 AT의 적절한 분리, 정량 및 특성은 immunometabolic 질병에서 자신의 역할을 이해하는 데 중요하다.
Abstract
비만 설치류와 인간의 지방 조직의 증가 식세포 침윤 (AT)의 발견은 로컬 및 전신 인슐린 저항 면역 세포 공헌에 대한 관심 강화하게되었다. 엎드려서 비만 AT 다른 면역 세포 집단의 분리 및 정량 지금 immunometabolism 실험실에서 일반적으로 활용 기법, 아직 극도의주의를 얻을 데이터가 안정적이고 해석되도록 기질 혈관 세포의 분리 및 유동 세포 계측법 분석을 모두 수행해야 . 이 비디오에서 우리는, 말하다 소화와 면역 세포가 풍부한 기질 혈관 부분을 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 우리는 항체 라벨 식세포와 T 림프구 방법과 유동 세포 계측법 실험에서 그들에 제대로 게이트하는 방법을 보여줍니다. 저지방 먹이 엎드려서 고지방 먹이 비만 쥐에서 대표 유동 세포 계측법 플롯이 제공됩니다. 이 분석의 중요한 요소는 어떻게 항체를 사용하는 것입니다대 식세포 AT 자연 autofluorescent중인 채널뿐만 아니라, 적절한 보상 컨트롤의 사용 형광 없습니다.
Introduction
역사적으로, 지방 조직 (AT)는 에너지 균형에 대한 응답으로 신축 지질 스토리지의 불활성 기관으로 조회되었습니다. 우리는 지금 AT 적극적으로 직접 먹이 행동과 조직의 포도당 항상성에 영향을 미치는 호르몬의 숫자를 분비 동적 내분비 기관을 나타내는 것을 알 수 있습니다. 또한, 지난 10 년 동안 각막 혈관 분획 (SVF)뿐만 아니라 항상성에 그들의 공헌 AT에 거주하는 면역 세포의 다양한 인구에 대한 증가하는 감사가있다.
1964 1 Rodbell에 의해 설명 된 지방 세포와 SVF는 콜라게나 다이제스트를 사용하여 AT를 분리하는 기능은 차등 원심 분리에 의해 따랐다. 콜라게나 II는 대부분 지방 세포의 인슐린 수용체 1의 보수에 의한 지방 세포와 SVF 분리하는 데 사용됩니다. AT의 초기에, 효소 분획은 주로 adipo을 연구하기 위해 고용되었다신진 대사를 cyte 및 preadipocytes를 분리 할 수 있습니다. 더 최근에, 흐름 cytometers의 광범위한 가용성과 상업적으로 이용 가능한 형광 – 복합 항체의 계속 증가와 함께이 기술은 면역 세포 AT의 특성을 촉진했다.
AT 염증 면역 세포의 존재가 이전에이 설명되어 있었지만, 와이즈 버그 등으로 정액 논문. 그리고 쑤 하였다. 출판은 2003 년에 염증성 사이토 카인을 분비하고 AT 별 및 조직 인슐린 저항성 3,4와 연관 비만 식세포 AT의 축적 (현금 인출기)을 문서화하는 첫번째이었다. 이러한 관찰은 연구의 새로운 분야의 기초 최근에, "immunometabolism,"10 신조어로 제공하고 돌기 세포 6, 비만 세포 7, T 세포 8 등 다양한 면역 세포 인구를, 연루 연구에 의해 미행 당하고있다 –10, B 세포 11, NKT 세포 12, 호산구 13, 및 호중구 비만 관련 인슐린 저항의 개발에 14,15.
이 문서의 목적은 SVF AT의 세포를 분리하고 현금 인출기의 특성 및 유동 세포 계측법을 통해 T 세포 AT에 사용되는 콜라 다이제스트 기술에 대한 자세한 설명을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 AT 마우스에 최적화되어 있지만, 시청자는 16 AT 인간이 기술의 최적화에 대한 광범위한 세부 정보를 제공하는 우수한 기사를 읽고 혜택을 누릴 수 있습니다. 이 문서의 대상은 제한된 경험 AT 마우스 작업 및 유동 세포 계측법을 수행하기에 수사관을 포함합니다. 시간과 자원을 가진 세포 수율과 생존의 균형을위한 몇 가지 실제적인 고려 사항은 면역 세포 인구 AT 특성화뿐만 아니라 최적의 유동 세포 계측법 컨트롤로 표시됩니다. 우리의 프로토콜뿐만 아니라, 독자 referr 있습니다적절한 컨트롤과 보상 17를 포함하는 유동 세포 계측법의 기술적 측면의 일부 훌륭한 토론 바수 등.의 최근 조브 기사에 에드.
Protocol
Representative Results
Discussion
비만의 신진 대사 결과에서 면역 체계의 역할에 대한 관심의 증가는 AT의 면역 세포를 특성화 유동 세포 계측법의 광범위한 사용하게되었다. 정확한 프로토콜은 자신의 경험과 장비를 사용할 기준으로 실험실 사이에 다를 수 있지만, 중요한 단계는 콜라 소화, 차등 원심 분리하고, 세포 표면 항원 라벨 (가) 있습니다. 본 문서의 목적은 AT 및 / 또는 유동 세포 계측법을 수행하는 작업에 대한 경험을…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JSO는 NIH 루스 L. 키르 NRSA (F32 DK091040)에 의해 지원됩니다, AK는 미국 당뇨병 협회 (7-10-MI-05)에서 박사후 원정대에 의해 지원되며, AHH는 미국 심장 협회 설립 탐정 수상에 의해 지원됩니다 (12EIA8270000). 유동 세포 계측법 실험은 VMC 유동 세포 계측법 공유 리소스에서 수행 하였다. VMC 유동 세포 계측법 공유 리소스는 밴더빌트 소화기 질환 연구 센터 (DK058404)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog # | |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 – 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents.
References
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