Summary

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Published: September 18, 2013
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Summary

Rezeptortyrosinkinasen sind bei vielen Krebs ektopisch exprimiert und sind als therapeutische Ziele bei akuter Leukämie identifiziert. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung der akuten Leukämie.

Abstract

Rezeptortyrosinkinasen sind bei der Entwicklung und Progression von vielen Krebsarten, einschließlich Leukämie und soliden Tumoren in Verbindung gebracht und sind attraktiv druggable therapeutische Ziele. Hier beschreiben wir eine effiziente Vier-Schritte-Strategie für die präklinische Bewertung von Tyrosin-Kinase-Inhibitoren (TKI) in der Behandlung der akuten Leukämie. Zunächst wird Western-Blot-Analyse verwendet, um die Ziel Inhibition in kultivierten Leukämiezellen zu bestätigen. Die funktionelle Aktivität wird dann unter Verwendung klonogene Assays in Methylcellulose oder Soft-Agar-Kulturen untersucht. Experimentelle Verbindungen, die Aktivität in Zellkulturassays zeigen, werden in vivo mit NOD-SCID-gamma (NSG) orthotop Mäusen mit menschlichen Leukämie-Zelllinien transplantiert ausgewertet. Erste In-vivo-Studien bewerten pharmakodynamische Zielhemmung in leukämischen Blasten aus dem Knochenmark isoliert. Dieser Ansatz wird verwendet, um die Dosis und Verabreichungsschema für eine effektive Zielsperre notwendig festzustellen,ion. Nachfolgende Studien bewerten die Wirksamkeit der TKI in vivo unter Verwendung von Luciferase exprimierenden Leukämiezellen, wodurch eine nicht-invasive Überwachung des Biolumineszenz Leukämie Belastung und Beurteilung der therapeutischen Reaktion unter Verwendung eines in vivo-Biolumineszenz-Bilderzeugungssystem. Diese Strategie wurde in vitro und in vivo wirksam war zur Bewertung der TKI und kann zur Identifizierung von molekular gezielte Wirkstoffe mit therapeutischem Potential oder zum direkten Vergleich und Priorisierung von mehreren Verbindungen eingesetzt werden.

Introduction

Akute lymphatische Leukämie (ALL) ist die häufigste Krebserkrankung bei Kindern 1,2. Die Gesamtüberlebensrate für Kinder-B-Zelllinien-ALL (B-ALL) ist etwa 85%, aber spezifische biologische Subtypen, darunter T-Zelllinien-ALL (T-ALL), haben immer noch schlechtere Prognose auch mit den aktuellen Therapieprotokolle. Die weitere Behandlung des rezidivierten ALL bleibt eine Herausforderung 3. Obwohl die Mehrheit der erwachsenen Patienten mit akuter Leukämie eine Remission zu erreichen mit Up-Front-Chemotherapie leiden viele Patienten immer noch 4 Rückfall. Strom Chemotherapien bei der Behandlung von akuter Leukämie bekannt, um Toxizität assoziierten kurz-und langfristige Nebenwirkungen verursachen. Daher werden weniger toxische Therapien, die spezifisch auf Krebszellen mit minimaler Wirkung auf normales Gewebe stark benötigt. In den letzten Jahren wurde der Schwerpunkt auf der Entwicklung von neuen, molekular gezielte Wirkstoffe mit Spezifität für Krebszellen oft unter Verwendung von iterativen Chemie platziertmehrere Wirkstoffe, die dann verglichen und priorisiert werden müssen 5 zu erzeugen. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung der TKI für die Behandlung von akuter Leukämie, die für die Bewertung einer einzigen Verbindung oder zur direkten Vergleich mehrerer Verbindungen, um die Medikamentenentwicklung zu erleichtern verwendet werden kann.

Die hier vorgestellten Verfahren besteht aus vier Schritten. Die erste biochemische (1) und Anti-Leukämie-(2)-Aktivitäten der Verbindung (en) sind in der Zellkultur untersucht, dann die Hemmung des Targets in Tiermodellen (3) bestätigt, und schließlich therapeutische Wirksamkeit des TKI (en) (4) in orthotopen Leukämie Xenotransplantatmodellen bestimmt. Für diese Untersuchungen ist es wichtig, relevante Zelllinien, die Vertreter der häufigsten biologischen Subtypen wählen. Zelllinien gewählt werden, die beide, ausdrücklich das Ziel, Interesse und fehlt das Ziel von Interesse, zu untersuchen, ob biologische Wirkungen med. sinddurch Hemmung der Ziel iated. Dies ist für die Entwicklung von kleinen Molekül-Inhibitoren, die Nebeneffekte, die für Anti-Tumor-Aktivität können besonders relevant. Es ist auch notwendig, um eine Zelllinie, die von der Ziel-zur funktionellen Wirkungen wie Proliferation oder Überleben zu wählen. Vorläufige Zielvalidierungsstudien (außerhalb des Umfangs dieses Artikels) mittels RNA-Interferenz-oder anderen spezifischen Mittel, um das Ziel zu hemmen, kann verwendet werden, um zielabhängigen Zelllinien zu identifizieren. Es ist auch wünschenswert, um Zelllinien, Maus-Xenotransplantaten, so daß Zellkulturergebnisse können mehr direkt übersetzt in in vivo Experimenten bilden können wählen.

Zur Bewertung der biochemischen Aktivität von TKIs in Leukämie-Zellen vermittelt wird, kann eine Abnahme der Rezeptor-Phosphorylierung als Indikator der Hemmung Ziel verwendet werden. Western-Blot-Analyse oder ELISA-Assays können verwendet werden, abhängig von der Verfügbarkeit und Spezifität von Antikörpern.Wenn Antikörper mit ausreichender Spezifität für das Ziel verfügbar sind, sind ELISA-Assays bevorzugt, da sie mehr quantitative und effizient sind. In Fällen, in denen Antikörper mit ausreichender Spezifität für ELISA nicht verfügbar sind, können Western-Blot-Analyse erforderlich sein. In diesem Fall kann die Immunpräzipitation von einer großen Menge an Lysat nützlich für die Detektion von Zielen, die in geringer Menge sind sein. Dieser Ansatz ist für die Messung von Phospho-Proteine, die eine kurze Halbwertszeit haben können, für schnelle Änderungen in der Signal in Reaktion auf Umweltreize ermöglichen besonders relevant. Einige phosphorylierte Proteine ​​sind extrem labil, wahrscheinlich als Ergebnis der Komplexbildung mit Phosphatasen. Für robuste und konsistente Detektion dieser phosphorylierten Proteine ​​kann es auch möglich sein, Zellen mit Pervanadat eine irreversible Protein-Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor 6 behandelt, um das Phospho-Protein vor der Herstellung ganzer Zellysate stabilisieren.

Zubestimmen, ob biochemische Aktivität ergibt Antitumorwirkungen können zielabhängigen biologischen Prozesse in Zell-basierten Experimenten beobachtet werden. Für Leukämie-Zelllinien, kann Anti-Leukämie-Aktivität durch TKI vermittelt mit Koloniebildungstests in Methylcellulose oder Soft-Agar-7 durchgeführt beurteilt werden. Weichagar kann bevorzugt sein, da dies ein festes Medium, das eher für die Manipulation wenn wiederholte Behandlung mit TKI erforderlich ist. Während viele akute myloid Leukämie (AML) Zelllinien Kolonien in Soft-Agar zu bilden, werden die meisten ALLE Zelllinien nur bilden Kolonien in Methylcellulose, die ein halbfestes Medium ist. Obwohl es möglich ist, mittel-und / oder Methylcellulose in TKIs Kulturen zu aktualisieren, kann nur kleine Mengen verwendet und mit begrenzten Frequenz werden. Ebenso ist es schwieriger, in Methylcellulose-Kolonien ohne Unterbrechung färben. Vorläufige Studien sollte die Fähigkeit von geeigneten Zelllinien, Kolonien in Methylcellulose und / oder Soft-Agar-und T-Form zu definierener optimale Dichte von Zellen in Kultur, so dass Kolonien sich nicht überlappen und in ausreichender Anzahl, um statistisch (üblicherweise 50-200 Kolonien pro 35 mm-Platte) erhalten relevanten Daten.

Während in-vitro-Assays sind robust und kostengünstig, und haben weniger ethischen Implikationen als ganze Tierversuche, Weiterentwicklung der therapeutischen Verbindungen erfordert Nachweis der Wirksamkeit und Sicherheit in Tiermodellen. Für die in vivo-Studien können menschliche akuten Leukämie-Zelllinien in orthotop NOD.Cg-Prkdc SCID transplantiert werden ich l2rg tm1Wjl / SZJ (NSG) Mäuse und TKI kann leicht durch Injektion oder orale Gabe verabreicht werden. Einige Zelllinien kann die Exposition von Mäusen NSG auf eine niedrige Zelllinie abhängige Dosis der Strahlung, um festzustellen, für Heterotransplantate erfordern, und in diesem Fall Mäuse können nicht tolerieren, ohne orale Gabe 5-10 Tage Erholungszeit nach der Bestrahlung. Dieses Manuskript beschreibt Generation der B-ALL und T-ALL-Heterotransplantate mitspezifische Zelllinien (697 und Jurkat) als Beispiele aber Xenotransplantaten in Mäusen NSG Verwendung einer großen Vielzahl von Zelllinien etabliert werden. In dem Fall, dass andere Zelllinien sind falls die Anforderung für die Bestrahlung, die optimale Anzahl von Zellen zu verpflanzen, und den Zeitpunkt der Entstehung und Progression Krankheit sollte experimentell bestimmt werden. Im Idealfall werden diese Modelle vollständiger Penetranz (jedes Tier transplantiert entwickelt Leukämie), konsistente Kinetik (Leukämie schreitet ähnlich bei allen Tieren) und eine angemessene Behandlungsfenster (idealerweise 20 bis 30 Tage zwischen Beginn der Behandlung und Entfernung aus der Studie aufgrund von Krankheit) haben . Die Anzahl der Zellen transplantiert erhöht werden, um kinetische Penetranz und Konsistenz zu verbessern oder verringert, um das Behandlungsfenster bei Bedarf zu verbessern.

Zu bestimmen, ob TKI vermitteln Ziel-Hemmung in vivo werden die Proben von Mäusen mit Leukämie Xenotransplantaten nach der Behandlung mit TKI oder nur Fahrzeug gesammelt. Idealerweise sollte die Dosis eind Zeitplan der Verwaltung für diese Experimente werden von pharmakokinetischen Studien, die oft von kommerziellen Labors durchgeführt und sind nicht in den Anwendungsbereich dieses Artikels geführt werden kann. Wenn pharmakokinetischen Daten verfügbar sind, kann die Konzentration der Verbindung für eine effektive Ziel Hemmung in der Zellkultur und die maximale Konzentration im Serum nach einer Einzeldosis von TKI erforderlich verwendet, um eine Anfangsdosis für Tierversuche zu definieren. Pharmakokinetischen Studien können auch den Zeitpunkt der Probenentnahme nach der Behandlung informieren pharmakokinetische Studien und die Art der Verabreichung. Inhibition des Ziels in jeder betroffenen Organs bewertet werden, aber die meisten Gewebe, die leicht erhoben und verarbeitet werden, sind bevorzugt. Die meisten akuten Leukämie-Zelllinien zu etablieren in der Leber, Knochenmark, der Milz, dem peripheren Blut und dem Zentralnervensystem, obwohl die spezifischen Organe betroffen und das Ausmaß der Transplantation dieser Organe variiert zwischen den Modellen. Die hier vorgestellte Protokoll beurteilt phospho-Protein-Hemmung im Knochenmark mittels Western Blot-Analyse, aber soliden Organen kann einfacher sein, konsequent ernten und benötigen nur minimale oder keine Verarbeitung vor dem Einfrieren, so dass weniger Gelegenheit für den Abbau von Phosphor-Proteine ​​während der Probensammlung und-verarbeitung. Immunhistochemie kann auch verwendet werden, um solide Tumoren oder Organe von Leukämie betroffen bewerten.

Schließlich wird die therapeutische Wirksamkeit des TKI (s) in orthotopen Leukämie-Xenograft-Modellen bestimmt. Aus diesen Untersuchungen kann der Zeitpunkt der Einleitung der Behandlung variiert werden, so dass Krankheit mehr oder weniger festgelegt. Die Behandlung kann unmittelbar nach der Transplantation für die ersten Studien beginnen und dann in nachfolgenden Studien verzögert, bis erhebliche Krankheitslast erkannt wird, um eine Diagnosebehandlungsmodell genauer anzunähern. Idealerweise haben diese Tiermodellen auch die Fähigkeit zur nicht-invasiven Messung der Krankheitsbelastung. Wir haben Verfahren für die Einführung der Firefly Lucifer optimiertase-Gen in Leukämie-Zelllinien mit Virus-ähnlichen Partikeln, so dass für nicht-invasive, Längsschnittanalyse der Krankheitsbeginn und Verlauf und Beurteilung der Krankheitslast im Knochenmark und soliden Organen. Entscheidend für diesen Ansatz ist die Verwendung von Luciferase-markierte monoklonale Zelllinien, um die Variabilität in der Entwicklung von Luciferase-exprimierenden Leukämie mit der Verwendung von polyklonalen Zellinien assoziiert zu verhindern, und ist nicht abhängig von der Behandlung mit einem TKI 8.

Zusammengenommen können diese Schritte für die Bewertung eines einzelnen TKI oder zum direkten Vergleich und Einstufung der mehreren TKIs verwendet werden. Während die Protokolle hier vorgestellt werden, zielen auf die Entwicklung von TKI, können diese Methoden, um andere Ziele angepasst werden und Überlegungen für die Assay-Entwicklung beschrieben. Somit kann diese Strategie im weiteren Sinne der präklinischen Bewertung von molekular gezielte Wirkstoffe anwendbar zur Behandlung von akuter Leukämie.

Protocol

Alle Experimente mit Tieren folgten die von der Universität von Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt regulatorischen Standards. Die nachgewiesene Protokoll wurde von der University of Colorado Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Phospho-Protein-Western Blot Herstellung von Lysaten Kulturzelllinien, die den Rezeptor-Tyrosin-Kinase von Interesse exprimieren. Ernten der Zellen und die Platte 3-5 x 10 6 Z…

Representative Results

Die hier vorgestellten Untersuchungen bewertet die biochemischen und funktionellen Wirkungen von TKI vermittelt und kann verwendet werden, um neue Verbindungen, basierend auf dem Grad der Ziel Inhibierung in vitro und in vivo werden einstuft, Reduktion der Koloniebildung und Verzögerung Leukämogenese NSG in Mäusen mit Luciferase-transplantierten getaggt Leukämiezellen. Immunoblot-Analyse wurde verwendet, um die Hemmung der aktiven phosphorylierten Form des Zielproteins …

Discussion

Diese Handschrift beschreibt eine wirksame Strategie zur Evaluierung neuer Tyrosinkinase-Inhibitoren bei der Behandlung von akuter Leukämie. Mit diesem Ansatz, biochemischen und Anti-Leukämie-Aktivitäten werden zunächst in zellbasierten Assays in vitro Xenotransplantat-Modelle in vivo ausgewertet und dann. Immunoblot-Analyse wurde erfolgreich verwendet, um die Hemmung der Ziel Tyrosinkinase in Leukämiezellen nach der Behandlung mit TKI demonstrieren und direkt vergleichen die Wirksamkeit von mehre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

In-vivo-Bildgebung wurde mit dem IVIS Shared Resource an der University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30-CA046934 unterstützt). Durchflusszytometrie wurde in der Durchflusszytometrie Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (durch Gewährung P30CA046934 unterstützt) durchgeführt. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die National Institutes of Health (RO1CA137078 DKG) unterstützt. ABLS ist ein Fellow des Pediatric Scientist Entwicklungsprogramm, durch Zuschüsse von der American Academy of Pediatrics, der American Pediatric Society und der Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850) unterstützt.

Materials

Reagent/Material
Hydrogen Peroxide MP Biomedicals #02194057 GHS05, GHS07, H302-H318
Sodium Orthovanadate Sigma #S6508 GHS07, H302+ H312+H332
2-Mercaptoethanol Sigma #M7522 GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410
ColonyGel Human Base Medium ReachBio #1101
3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) Sigma #M5655 GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341
Difco Noble Agar BD Biosciences #214883
Nitrotetrazolium Blue Chloride Sigma #N6639 GHS07, H302
D-Luciferin Firefly, Potassium Salt PerkinElmer #122796
4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride Sigma #D9542
FITC CD45 BD Bioscience #347463
FITC Mouse IgG1 Isotype control BD Bioscience #51-35404X-2
Gentamycin Sulfate Sparhawk #NDC58005-633-04
Protease Inhibitors Roche #11836153001
DNase Sigma #D4263
Protein G Beads Invitrogen #10-1242
Isofluran VETONE #NDC13985-030-60
Equipment
Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm Nunclon #D7804-500EA
Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm Nunclon #D8429-1CS
6-well plates BD Bioscience #353046
14 gauge x 4 inch blunt-end needles Cadence science #7956
5 ml syringe with luer-lok BD Bioscience #309646
GelCount automated colony counter Oxford Optronix
In vivo bioluminescence imaging system PerkinElmer #IVIS200
Scout pro portable balances, scale Ohaus #SP202
Broome style rodent restrainer Plas-labs #551-BSRR
Ear punch, punch diameter: 2 mm FST #24210-02
Chlorhexidine swabs, Prevantics PDI #B10800
Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 Monoject #8881500042
Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile Instech #FTP-20-38
1 mL Luer-Lok disposable syringe BD Bioscience #309628
Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle BD Bioscience #329465
Extra fine bonn scissors FST #14084-08
Student fine scissors FST #91460-11
Moria ultra fine forceps FST #11370-40
Extra fine graefe forceps FST #11150-10
Scalpel handle FST #10003-12
Scalpel blades FST #10011-00

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check_url/cn/50720?article_type=t

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Christoph, S., Lee-Sherick, A. B., Sather, S., DeRyckere, D., Graham, D. K. Pre-clinical Evaluation of Tyrosine Kinase Inhibitors for Treatment of Acute Leukemia. J. Vis. Exp. (79), e50720, doi:10.3791/50720 (2013).

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