Microscopia a fluorescenza metodi per determinare la vitalità di batteri in associazione con cellule di mammifero

Summary

Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l'esposizione a cellule eucariotiche. Questo articolo descrive i protocolli per l'uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all'interno e associati alle cellule ospiti.

Abstract

Centrale al campo della patogenesi batterica è la capacità di definire se e come i microbi sopravvivono dopo l'esposizione a cellule eucariotiche. Attuali protocolli per affrontare tali questioni comprendono saggi di conteggio delle colonie, saggi di protezione gentamicina e microscopia elettronica. Conteggio delle colonie e di protezione gentamicina saggi valutano solo la vitalità di tutta la popolazione batterica e sono in grado di determinare la vitalità batterica individuale. La microscopia elettronica può essere utilizzata per determinare la fattibilità di singoli batteri e fornire informazioni sulla loro localizzazione in cellule ospiti. Tuttavia, i batteri spesso mostrano una gamma di densità di elettroni, rendendo la valutazione della vitalità difficile. Questo articolo descrive i protocolli per l'uso di coloranti fluorescenti che rivelano la vitalità dei singoli batteri all'interno e associati alle cellule ospiti. Questi test sono stati sviluppati inizialmente per valutare la sopravvivenza di Neisseria gonorrhoeae in neutrofili umani primari, ma dovrebbe essere unApplicabile a qualsiasi interazione cellula batterio-ospite. Questi protocolli si combinano coloranti fluorescenti membrana permeabile (SYTO9 e 4 ',6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), che macchia tutti i batteri, con coloranti membrana impermeabile fluorescente (propidio ioduro e Sytox verdi), che sono accessibili solo a batteri non vitali. Prima di permeabilizzazione cellula eucariotica, viene aggiunto un anticorpo o reagente fluorescente per identificare i batteri extracellulari. Così questi saggi discriminano la vitalità dei batteri aderente e all'interno delle cellule eucariotiche. Un protocollo è prevista anche per utilizzare i coloranti redditività in combinazione con anticorpi fluorescenti a marcatori di cellule eucariotiche, al fine di determinare la localizzazione subcellulare di singoli batteri. I coloranti vitalità batterica discussi in questo articolo sono un complemento sensibili e / o alternative alle tecniche di microbiologia tradizionali per valutare la fattibilità dei singoli batteri e fornire informazioni riguardanti dove i batteri sopravvivono nella cellula ospites.

Introduction

C'è una interazione dinamica e co-evoluzione tra i batteri ei padroni di casa in cui risiedono. I batteri si sono evoluti organelli aderenza, sistemi di secrezione e / o la capacità di produrre tossine che consentono loro infezione produttiva di phagocytic host e le cellule non fagocitarie. I batteri devono anche vedersela con il riconoscimento e l'attività antimicrobica del sistema immunitario dell'ospite. Il sistema immunitario ospite comprende componenti innate e adattative comprese barriere fisiche e chimiche, cellule immunitarie, il sistema del complemento, e altri componenti di immunità umorale. Mentre molti batteri sono suscettibili di abbattimento e passaggio della risposta immunitaria ospitante multistrato, alcuni batteri patogeni e opportunisti sono evoluti meccanismi per infettare una varietà di cellule ospiti e sovvertire passaggio della risposta immunitaria ospitante ^1. Neisseria gonorrhoeae è un esempio di un batterio patogeno che è altamente adattato a persistere nel suo ospite umano. N. gonorrhoeae colonizza facilmente le superfici luminali delle cellule epiteliali della mucosa del tratto urogenitale, faringe, congiuntiva, e del retto. Colonizzazione innesca l'abbondante assunzione di neutrofili nei siti mucosali. I neutrofili sono fagociti professionali che possiedono una varietà di processi antimicrobici per uccidere i microrganismi, tuttavia, N. gonorrhoeae è in grado di sopravvivere in presenza di neutrofili ^2-5. Capire come batteri patogeni come N. gonorrhoeae sovvertire, sopprimere, e dirottare la risposta immunitaria a sopravvivere in ultima analisi, in ambienti host normalmente ostili è cruciale per lo sviluppo di nuove terapie per la lotta contro le malattie infettive.

Protocolli sperimentali usati spesso per studiare la sopravvivenza dei batteri nelle cellule ospiti comprendono saggi di conteggio delle colonie, saggi di protezione gentamicina e microscopia elettronica. In saggi conteggio delle colonie, una popolazione di cellule infette viene lisato (per esempio, con un detergente a which i batteri sono resistenti) per liberare i batteri. I lisati sono diluiti e piastrate su supporti a base di agar, e unità formanti colonie nei lisati vengono enumerate per ciascun punto di tempo e / o condizione sperimentale. Questo approccio riporta la redditività di tutta la popolazione batterica, ma non è in grado di distinguere tra intracellulare ed extracellulare sopravvivenza. Una variazione del dosaggio conteggio delle colonie, il test di protezione gentamicina, misuri specificamente sopravvivenza batterica intracellulare, basato sulla incapacità dei gentamicina antibiotico per attraversare la membrana plasmatica eucariotica ^6. Tuttavia, questo test dipende dai batteri essendo suscettibile di uccisione da gentamicina (o altro antibiotico che è simile eucariotico membrana impermeant) e l'incapacità di antibiotico per avere accesso ai batteri interne. Pertanto, un test di protezione gentamicina può non essere efficace per l'esame di tutte le specie batteriche o nell'esame sopravvivenza batterica altamentecellule pinocytic come neutrofili. Nessuno di questi approcci rivela la localizzazione subcellulare o altri comportamenti di batteri individuali (ad esempio, se i batteri formano aggregati o microcolonie che si comportano diversamente da cellule batteriche individuali). Un altro approccio frequentemente utilizzato per esaminare la fattibilità dei singoli batteri esterni e interni è sottile-sezione di microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Questo approccio è vantaggioso in quanto può fornire informazioni sulla posizione dei batteri in cellule ospiti (es phagosome, citoplasma, dell'autofagosoma), che può essere ulteriormente esaminato al microscopio immunoelettronica con anticorpi oro accoppiata contro marcatori subcellulari. Tuttavia, microscopia elettronica non è particolarmente sensibile a valutare vitalità batterica. Quando le sezioni incorporati vengono colorate con acetato di uranile, citrato di piombo, o altri reagenti elettrone-densi e ripreso al microscopio elettronico, i batteri elettrone-densi sono considerati vitali ed elettronichetron-Lucent non vitali ^7,8. Tuttavia, questa ipotesi sopravvaluta vitalità batterica, dal momento che solo i batteri morti con membrane gravemente perturbati e privo di citoplasma appare elettrone-Lucent. Inoltre, alcune specie batteriche possono visualizzare una gamma di densità di elettroni a seconda della loro fase di crescita, rendendo difficile determinare la vitalità.

In alternativa o in aggiunta a questi metodi ampiamente utilizzati, qui forniamo protocolli e razionale per l'uso di coloranti fluorescenti che indicano vitalità batterica per valutare la sopravvivenza dei batteri attaccati ae internalizzati dalle cellule ospiti. Per identificare i batteri extracellulari, cellule infettate vengono prima esposti a un reagente fluorescente, come una lectina o anticorpo specifici batteri. Le cellule infettate vengono permeabilizzate ed esposti a coloranti specifici di DNA che sono differenzialmente accessibili ai batteri con membrane intatte vs degradati, come surrogato vitalità batterica. Nel primo protocol, la membrana permeabile colorante SYTO9 identifica la popolazione batterica totale, mentre ioduro di propidio è accessibile solo a quei batteri che hanno compromesso le membrane e sono quindi considerate non vitali. Ioduro di propidio e SYTO9 sono stati utilizzati per valutare la vitalità batterica in biofilm, discriminare patogeni dai batteri non patogeni, ed enumerare a base d'acqua batteri vitali ^9-12. Nel secondo protocollo, 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) identifica i batteri totali, mentre Sytox verde è accessibile solo alla popolazione non vitali. Queste coppie vitalità coloranti possono essere combinati con immunofluorescenza per determinare la posizione di ciascun batterio in relazione ad una proteina di interesse, ad esempio per definire localizzazione subcellulare batterica. L'uso di questi test fornisce informazioni chiave nelle interazioni che provocano battericida o sopravvivenza durante l'infezione delle cellule ospiti. I protocolli descritti in questo articolo sono stati usati per valutare la fattibilità diN. gonorrhoeae che è attaccato e dentro neutrofili umani primari, tra cui in diverse popolazioni di phagosomes neutrofili ^5,13,14. Tuttavia, questi protocolli possono essere applicati per valutare la vitalità dei batteri gram-positivi e gram-negativi in fagociti professionali, fagociti non professionali, e protozoi ^15-24.

Protocol

1. Valutare batterica Viabilità con ioduro di propidio e SYTO9 Infettare le cellule che sono aderenti a 12 mm di diametro vetrini circolari in piastre da 24 pozzetti con batteri di interesse. NON fissare le cellule con aldeidi o solventi organici. Lavare le cellule una volta delicatamente in 0.1 M 3 – (N-morfolino) Acido propanosulfonico (MOPS), pH 7.2, contenente 1 mM MgCl2 (MOPS / MgCl 2). Incubare le cellule per 10 minuti al buio a temperatura amb…

Representative Results

I protocolli descritti sono stati usati per esaminare la sopravvivenza di N. gonorrhoeae dopo l'esposizione al primario dell'uomo neutrofili 5,26. I neutrofili sono stati infettati con N. gonorrhoeae e trattati con protocollo 1, utilizzando la vitalità SYTO9 colorante verde fluorescente e lo ioduro di propidio-rosso fluorescente (Figura 4A). I coloranti sono stati aggiunti in presenza di saponina, che sequestra colesterolo per permeabilize preferenzialmente membrane…

Discussion

Qui presentati sono due protocolli che utilizzano legame al DNA e coloranti vitalità in combinazione con una lectina fluorescente per identificare batteri vivi e morti allegate e dentro le cellule umane. Poiché entrambi i protocolli effettivamente discriminare in diretta da batteri morti, la scelta di quale protocollo da utilizzare dipende l'obiettivo dell'esperimento. Il primo protocollo utilizza ioduro di propidio per rilevare i batteri non vitali e SYTO9 per rilevare i batteri intatti. Mostrato nella <stron…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection	Becton Dickinson	367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml	Becton Dickinson	366480
Sterile water for irrigation	Baxter	07-09-64-070
Dextran 500	Sigma	31392
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S641
Dextrose	Ricca Chemical Company	RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll solution	GE Healthcare	17-1440-03
Acetic Acid	Fisher Scientific	BP2401
12 mm circular glass coverslips	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24-well plates	Corning Incorporated	3524
Pooled Human Serum	Sigma	S7023
RPMI	Mediatech	15-040-CV
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007103
Human interleukin-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
Propidium Iodide	Life Technologies	L7007 or L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 or L7012
Saponin	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
Mouse anti-CD63	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit	Life Technologies	A20187
Hemacytometer Bright Line	Hausser Scientific	1492
Forceps	EMS	78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge	Thermo Scientific	75004377