In vitro Essai de coculture pour évaluer la migration transépithéliale des neutrophiles induite par l’agent pathogène
Summary
La migration trans-épithéliale de neutrophile en réponse à l’infection bactérienne muqueuse contribue aux dommages épithéliaux et à la maladie clinique. Un modèle in vitro a été développé qui combine l’agent pathogène, les neutrophiles humains, et les couches humaines polarisées de cellules épithéliales cultivées sur des filtres de transwell pour faciliter des investigations vers démêler les mécanismes moléculaires orchestrant ce phénomène.
Abstract
Les surfaces muqueuses servent de barrières protectrices contre les organismes pathogènes. Les réponses immunitaires innées sont activées lors de la détection de l’agent pathogène conduisant à l’infiltration de tissus avec des cellules inflammatoires migratrices, principalement des neutrophiles. Ce processus a le potentiel d’être destructeur pour les tissus s’il est excessif ou maintenu dans un état non résolu. Des modèles in vitro cocultured peuvent être utilisés pour étudier les mécanismes moléculaires uniques impliqués dans la migration trans-épithéliale induite par l’agent pathogène de neutrophile. Ce type de modèle offre une polyvalence dans la conception expérimentale avec possibilité de manipulation contrôlée de l’agent pathogène, de la barrière épithéliale ou des neutrophiles. L’infection pathogène de la surface apicale des monocouches épithéliales polarisées cultivées sur des filtres perméables de transwell incite basolateral physiologiquement approprié à la migration trans-épithéliale apicale des neutrophiles appliquées à la surface basolateral. Le modèle in vitro décrit ici démontre les étapes multiples nécessaires pour démontrer la migration de neutrophile à travers une monocouche épithéliale polarisée de poumon qui a été infectée par le pathogène P. aeruginosa (PAO1). L’ensemencement et la culture des transwells perméables avec les cellules épithéliales dérivées humaines de poumon est décrit, avec l’isolement des neutrophiles du sang humain total et la culture de PAO1 et de K12 E. coli non pathogène (MC1000). Le processus émigrationnel et l’analyse quantitative des neutrophiles migrés avec succès qui ont été mobilisés en réponse à l’infection pathogène sont montrés avec des données représentatives, y compris des contrôles positifs et négatifs. Ce système de modèle in vitro peut être manipulé et appliqué à d’autres surfaces muqueuses. Les réponses inflammatoires qui impliquent l’infiltration excessive de neutrophile peuvent être destructives aux tissus de centre serveur et peuvent se produire en l’absence des infections pathogènes. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui favorisent la migration transépithéliale des neutrophiles par la manipulation expérimentale du système d’analyse de coculture in vitro décrit ici a un potentiel significatif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour une gamme de maladies infectieuses et inflammatoires muqueuses.
Introduction
Les surfaces muqueuses servent de barrières physiques et immunologiques offrant une protection contre les menaces externes omniprésentes dans l’environnement1,2. Cette barrière épithéliale protectrice peut être compromise lorsque des organismes pathogènes envahissent2. Dans le cas d’un agent pathogène bactérien, cette rencontre provoque souvent un processus inflammatoire en activant le système immunitaire inné et en déclenchant une mobilisation rapide des granulocytes premiers répondants appelés neutrophiles2-4. Les agents chimiotactiques facilitant le recrutement des neutrophiles sont produits en partie par les cellules épithéliales muqueuses cherchant à débarrasser l’hôte de l’agent pathogène incriminé2-4. Infiltration excessive ou non résolue de neutrophiles de la surface épithéliale muqueuse peut provoquer une pathologie importante1,5. Il s’agit d’une conséquence des lésions tissulaires non spécifiques causées par l’arsenal neutrophile antibactérien5-7. Dans de tels cas, la capacité bactérienne de clairance des neutrophiles est éclipsée par la destruction du tissu de centre serveur pendant une insulte infectieuse. La perturbation de la fonction protectrice de la barrière épithéliale peut entraîner une exposition accrue des tissus sous-jacents à des micro-organismes et/ou à des toxines, exacerbant davantage la pathologie de la maladie8,9. Ces conséquences peuvent être observées dans plusieurs systèmes d’organes, y compris le poumon et le tube digestif1,5. En outre, les conditions inflammatoires non infectieuses telles que les épisodes sévères d’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) et la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) sont marquées par la rupture pathologique de la barrière épithéliale muqueuse par une réponse neutrophile excessive4,5,10-12.
Le processus complexe de recrutement des neutrophiles suivant une infection muqueuse implique plusieurs étapes compartimentées1,5,13,14. Tout d’abord, les neutrophiles doivent s’écarter de la circulation via une série d’interactions de cellule à cellule qui facilitent la migration trans-endothéliale1,13. Les neutrophiles naviguent ensuite dans l’espace interstitiel existant contenant la matrice extracellulaire1,14. Pour atteindre la lumière de la muqueuse infectée, les neutrophiles doivent alors migrer à travers la barrière épithéliale1,4,5. Ce phénomène complexe en plusieurs étapes est souvent étudié dans son ensemble à l’aide de modèles animaux in vivo d’infection15. De tels modèles sont utiles pour établir la nécessité de facteurs spécifiques, tels que les chimiokines, les molécules d’adhésion ou les voies de signalisation qui participent au processus global, mais sont largement inadéquats pour résoudre les contributions moléculaires critiques pour chaque étape compartimentée distincte16. Les systèmes in vitro coculturels modélisant la migration trans-endothéliale, trans-matricielle ou trans-épithéliale des neutrophiles ont été particulièrement utiles à cet égard1,14,16,17.
Un système robuste de dosage de coculture a été développé dans le but de déchiffrer les mécanismes responsables de la migration transépithéliale des neutrophiles en réponse à l’infection pathogène18-22. Ce modèle consiste à infecter la surface apicale des couches de cellules épithéliales humaines polarisées avec un agent pathogène bactérien suivie de l’application de neutrophiles humains fraîchement isolés sur la surface basolatérale18-22. Les neutrophiles migrent à travers la barrière épithéliale en réponse aux produits chimiotactiques épithéliaux-dérivés sécrétés après l’infection pathogène18,21-23. Ce système modèle a été utilisé en utilisant des cultures épithéliales intestinales et pulmonaires exposées à des agents pathogènes bactériens spécifiques aux tissus appropriés et a dévoilé de nouveaux mécanismes moléculaires probablement importants pour le processus de recrutement des neutrophiles lors de l’infection muqueuse3,8,19,24-28. La force de ce modèle de coculture in vitro est qu’une approche réductionniste permet au chercheur de manipuler expérimentalement l’agent pathogène, la barrière épithéliale et/ou le neutrophile dans un système bien contrôlé, hautement reproductible et assez peu coûteux. Les informations recueillies à partir de cette approche peuvent être efficacement exploitées pour effectuer une analyse ciblée des événements compartimentés lors du recrutement des neutrophiles à l’aide de modèles d’infection in vivo 22,29,30.
Cet article démontre les étapes multiples nécessaires pour que l’établissement réussi de ce modèle reproductible explore la migration trans-épithéliale induite par neutrophile par microbe pathogène. Des barrières épithéliales de poumon infectées avec l’agent pathogène Pseudomonas aeruginosa sont présentées dans cet article ; cependant, d’autres épithéliums tissulaires et agents pathogènes peuvent être substitués avec des modifications mineures. L’ensemencement et la culture des couches polarisées de cellules épithéliales de poumon sur les filtres perméables enrobés de collagène inversés sont détaillés ci-dessous, de même que la croissance de l’aeruginosa pathogène de P. et l’isolement des neutrophiles du sang total. Comment ces composants sont combinés pour observer la migration trans-épithéliale induite par le microbe pathogène de neutrophile est présentée avec les contrôles positifs et négatifs appropriés pour établir une analyse reproductible. La polyvalence de cette approche pour examiner de divers aspects de la migration trans-épithéliale induite par neutrophile par microbe pathogène est discutée concernant des études spécifiques dans la littérature.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migration des neutrophiles à travers les surfaces épithéliales muqueuses est une caractéristique commune dans la pathologie de la maladie après une infection par des agents pathogènes bactériens3. La méthodologie décrite ici offre une approche rapide et simple pour isoler expérimentalement cet événement discret en utilisant un système d’analyse de coculture in vitro dérivé de cellules humaines qui modélise une caractéristique du processus inflammatoire déclenché par des infecti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus financièrement par les NIH (1 R01 AI095338-01A1).
Materials
| NCl-H292 cells | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 medium | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) liquid | Invitrogen | 14190-144 | without calcium and magnesium |
| Heat Inactivated Fetal bovine serum | Invitrogen | 10082-147 | 10% added to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 10,000 units of penicillin and 10,000 µg of streptomycin per ml. |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50 ml aliquots are stored frozen at -20 ºC. Aliquot in use can be stored at 4 ºC short-term. |
| Hank's Balanced Salt Solution – HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | Sterile, without calcium and magnesium |
| Trypan Blue Solution | Invitrogen | 15250-061. | Stock = 0.4% |
| Collagen, Rat Tail | Invitrogen | A10483-01 | Can also be isolated in the laboratory directly from the tails of rats using standard protocols |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909-500G | Component of 1 M citrate buffer and acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Sodium Citrate | Sigma-Aldrich | S4641-500G | Component of 1 M citrate buffer |
| Dextrose anhydrous | Sigma-Aldrich | D8066-250G | Component of acid citrate dextrose (ACD) solution |
| Ammonium Chloride | Sigma-Aldrich | 213330-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | Component of red blood cell (RBC) lysis buffer |
| HBSS(+) powder | Sigma-Aldrich | H1387-10L | Key component of HBSS+ |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | Component of HBSS+ |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | Follow vendor instructions to coat glass pipette tips |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | Key component of ABTS substrate solution |
| 30% Hydrogen Peroxide Solution | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Component of ABTS substrate solution |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP or fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | A Stock solution of 10 mM in DMSO should be prepared and aliquots stored at -20 ºC. |
| Gelatin Type B | Fisher Scientific | M-12026 | |
| Pseudomonas isolation agar | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | Follow manufacturer’s instructions to make PIA plates |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | Optional, can improve neutrophil purity |
| Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well migration plate | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24-well wash plate | Falcon | 35-1147 | Can be reused if soaked in 70% ethanol and washed thoroughly prior to reuse |
| 96-well plate | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Transwell Permeable Supports | Corning Incorporated | #3415 | Polycarbonate; Diameter: 6.5 mm; Growth area: 0.33 cm2; Dish style: 24-well plate; Pore size: 3.0 µm |
| Petri dish | Falcon | 35-1013 | Each Petri dish holds 24 inverted 0.33 cm2 Transwells. |
| 500 ml 0.2 μm filter / flask | Fisher Scientific | 09-740-25A | To sterilize acid citrate dextrose (ACD) solution |
| 5-3/4 in glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | Coat tips with Sigmacote prior to use |
| Hemostat | Fisher Scientific | 13-812-14 | Curved, Serrated |
| Invertoskop Inverted Microscope | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max Microplate Reader | Molecular Devices | #432789 |
References
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
- McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
- Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
- Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
- Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil’s role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
- Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
- Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
- Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
- Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
- Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
- Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
- Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
- Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
- Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
- Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
- McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
- McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
- Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
- Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
- McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
- Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
- Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
- Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
- McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
- Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
- Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
- Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
- Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
- Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
- Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
- Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
- Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
- Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
- Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
- Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
- Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
- Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
- Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
- Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
- Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).
