Potenziale di membrana Dye Imaging di ventromediale dell'ipotalamo neuroni da topi adulti per studiare glucosio Sensing
Summary
L'attività di singoli neuroni di topi-adulti di età può essere studiato dissociandosi neuroni da regioni specifiche del cervello e l'utilizzo di membrana fluorescenti potenziale di imaging colorante. Da sperimentazioni risposte alle modifiche del glucosio, questa tecnica può essere utilizzata per studiare la sensibilità glucosio di adulti neuroni ipotalamici ventromedial.
Abstract
Studi di attività neuronale vengono spesso eseguite utilizzando i neuroni di roditori meno di due mesi di età a causa delle difficoltà tecniche connesse con l'aumento del tessuto connettivo e diminuiscono la vitalità neuronale che si verificano con l'età. Qui, descriviamo una metodologia per la dissociazione di sano neuroni ipotalamici di topi adulti di età. La capacità di studiare i neuroni da topi adulti età consente l'utilizzo di modelli di malattia che si manifesta in età più avanzata e potrebbe essere più evolutivamente accurato per alcuni studi. Imaging di fluorescenza dei neuroni dissociati può essere usato per studiare l'attività di una popolazione di neuroni, anziché utilizzare elettrofisiologia per studiare un singolo neurone. Ciò è particolarmente utile quando si studia una popolazione eterogenea neuronale in cui il tipo neuronale desiderato è raro come per i neuroni ipotalamici glucosio sensing. Abbiamo utilizzato potenziale di membrana di imaging tintura di adulti neuroni ipotalamici ventromedial di studiare le loro risposte a chaNGES in glucosio extracellulare. Neuroni sensori del glucosio si ritiene di svolgere un ruolo centrale nella regolazione del bilancio energetico. La possibilità di studiare sensing del glucosio nei roditori adulti è particolarmente utile in quanto la prevalenza di malattie legate al bilancio energetico disfunzionale (ad es. Obesità) aumenta con l'età.
Introduction
Il cervello regola l'omeostasi energetica attraverso il sistema neuroendocrino e nervoso autonomo. L'ipotalamo ventromediale (VMH), composto dal nucleo ventromediale (VMN) e il nucleo arcuato (ARC), è importante per la regolazione centrale dell'omeostasi energetica. Specializzati neuroni sensori del glucosio, all'interno del VMH, attività collegamento neuronale e periferico omeostasi del glucosio 1. Ci sono due tipi di glucosio sensing neuroni; glucosio eccitati (GE) neuroni aumentano mentre il glucosio inibita (GI) neuroni diminuiscono la loro attività di aumenti di glucosio extracellulare. Neuroni rilevamento VMH glucosio sono generalmente studiate usando elettrofisiologia o calcio / potenziale di membrana di imaging colorante sensibile.
La tecnica patch clamp elettrofisiologia è considerato il gold standard nello studio ex vivo di attività neuronale. In questa tecnica, un elettrodo micropipetta di vetro è attaccato alla membrana cellulare tramite una elevata resistenza(GΩ) sigillo. Elettrodi di patch clamp consentono la registrazione in tempo reale di azione potenziale frequenza (pinza di corrente) o conduttanza ionica (morsetto di tensione) cambia all'interno di un singolo neurone. Mentre la tecnica patch clamp fornisce informazioni dettagliate concernenti le modifiche specifiche conduttanze del canale ionico, un grave inconveniente è che solo neurone può osservata alla volta. Ci vogliono circa 30-45 min di registrazione per verificare che si sta registrando da un neurone di rilevamento del glucosio prima ancora di iniziare un trattamento sperimentale specifico. Inoltre, GI e GE neuroni comprendono <20% della popolazione totale neuronale VMH. Ad aggravare il problema è la mancanza, in molti casi, di un marcatore cellulare per identificare questi neuroni. Pertanto, è chiaro che, nonostante fornendo informazioni elettriche preziose che altre tecniche non possono, analisi patch clamp è laborioso, richiede tempo e bassa resa.
L'uso di imaging di fluorescenza dei neuroni VMH dissociate consente lo studio di hundreds di neuroni contemporaneamente. Coloranti sensibili calcio possono essere usati per misurare le variazioni di calcio intracellulare, che indirettamente correlano alle variazioni dell'attività neuronale. Potenziale di membrana coloranti sensibili vengono utilizzati per monitorare membrana potenziali cambiamenti. Misurazione del potenziale di membrana cellulare è un indice più diretta dell'attività neuronale rispetto a variazioni dei livelli di calcio intracellulare. Inoltre, potenziale di membrana immagini colorante (MPD) rileva potenzialmente piccoli cambiamenti nel potenziale di membrana in cui l'azione potenziale di cottura non viene alterata e livelli intracellulari di calcio potrebbe non cambiare. Entrambe queste tecniche di imaging di fluorescenza sono stati utilizzati per studiare i neuroni VMH di rilevamento del glucosio da topi giovanile 2-7. Mentre i risultati sono meno dettagliate di quelle ottenute con patch clamp elettrofisiologia, la forza di esperimenti di imaging è che contemporaneamente valutare una vasta popolazione di cellule che includono inevitabilmente un numero significativo di neuroni sensori di glucosio. MPD di imaging is particolarmente utile per studiare i neuroni GI che sono più uniformemente localizzata nell'intero VMH, fornendo così una popolazione adeguato allo studio nel VMH dissociato (~ 15% GI). Al contrario, mentre i neuroni GE sono densamente localizzate al ventrolateral-VMN e cella regione povera tra l'ARC e VMN, non rappresentano un numero significativo di neuroni nel VMH (<1% GE). Inoltre, studiando i neuroni isolati, astrociti e gli effetti presinaptici sono eliminati. Questo può essere un vantaggio nello studiare effetti primo ordine neurone, così come uno svantaggio in quanto le connessioni e processi fisiologici vengono persi.
Un fattore limitante sia elettrofisiologia patch clamp e MPD / Imaging di calcio colorante è la necessità di utilizzare gli animali più piccoli (ad es. Topi o ratti <8 settimane di età). Questo è principalmente dovuto all'aumento del tessuto connettivo in combinazione con diminuita vitalità neuronale che si verifica con l'età. Nel cervello-slice elettrofisiologia pernoi, aumento del tessuto connettivo rende più difficile visualizzare i neuroni. Tessuto connettivo aumentato rende anche più difficile dissociare un gran numero di neuroni sani per studi di imaging. Inoltre, i neuroni provenienti da animali più giovani sopravvivono più a lungo durante la registrazione patch clamp o immagini. Tuttavia, l'uso di giovani mouse può essere una limitazione importante. Attività neuronale e / o risposte a neurotrasmettitori o sostanze nutritive circolanti cambiano con l'età. Ad esempio, dal momento che il bilancio energetico è strettamente legata allo stato riproduttivo, i neuroni ipotalamici che regolano il bilancio energetico possono rispondere in modo diverso in pre-vs animali postpubescent. Inoltre, molte malattie richiedono un trattamento a lungo termine o non si manifestano fino all'età adulta. Primi esempi di tali malattie sono l'obesità o diabete di tipo 2 dieta. Dal momento che i neuroni sensibili al glucosio si ritiene di svolgere un ruolo in queste patologie abbiamo sviluppato una metodologia per la coltura di successo adulti sani VMH neuroni per l'uso in immagini MPD experiments.
Protocol
Representative Results
Discussion
La chiave per poter studiare l'attività dei neuroni da topi adulti è la capacità di dissociare neuroni sani. Dissociazione dei neuroni ipotalamici di topi adulti è più difficile in diversi passaggi chiave nel protocollo rispetto ai neuroni di topi giovani. Abbiamo superare questo problema in vari modi. Fare fette spesse 500 micron di cervello riduce al minimo i danni meccanici ai neuroni rispetto ai soliti 250-350 micron fette utilizzati per il tessuto cerebrale di topi più giovani. Tuttavia, fette spesse rich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
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