Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

Summary

Bacteriën produceren uitgescheiden verbindingen die het potentieel heeft om de fysiologie van hun microbiële buren beïnvloeden. Hier beschrijven we een coculture scherm dat de opsporing van dergelijke chemisch gemedieerde interspecies interacties door het mengen bodemmicroben met fluorescerende transcriptionele reporter stammen van Bacillus subtilis op vaste media toelaat.

Abstract

In de natuur, bacteriën zelden in een isolement bestaan, ze zijn in plaats omgeven door een divers scala van andere micro-organismen die de lokale omgeving te veranderen door het afscheiden van metabolieten. Deze metabolieten hebben het potentieel om de fysiologie en de differentiatie van hun microbiële buren moduleren en zullen waarschijnlijk een belangrijke rol in het opzetten en onderhouden van complexe microbiële gemeenschappen. We hebben een fluorescentie gebaseerde coculture scherm dergelijke chemisch gemedieerde microbiële interacties identificeren ontwikkeld. Het scherm omvat het combineren van een tl-transcriptionele reporter stam met milieu-microben op vaste media en waardoor de kolonies groeien in coculture. De fluorescerende transcriptionele reporter is ontworpen dat de gekozen bacteriestam fluoresceert wanneer het uitdrukken van een bepaald fenotype van belang (bijvoorbeeld biofilmvorming, sporulatie, virulentiefactor productie, enz..) Screening wordt uitgevoerd onder kweekomstandigheden where dit fenotype niet tot expressie (en dus de reporterstam typisch niet-fluorescerende). Wanneer een milieu microbe scheidt een metaboliet die dit fenotype activeert, diffundeert door de agar en activeert de fluorescente reporter construct. Hierdoor kan het inducerende-metaboliet producerende microbe te detecteren: zij zijn niet-fluorescerende kolonies meest proximaal van de fluorescerende kolonies. Zo, dit scherm kan de identificatie van milieuaspecten microben die dampdoorlatend metabolieten die een bepaalde fysiologische respons bij een reporter stam activeren produceren. Deze publicatie wordt beschreven hoe u: a) selecteer de juiste coculture screening voorwaarden, b) de voorbereiding van de verslaggever en milieu microben voor screening, c) voert de coculture scherm, d) isoleren vermeende inducerende organismen, en e) bevestigen hun activiteit in een tweede scherm. We ontwikkelden deze methode voor het screenen op bodemorganismen die biofilm matrix-productie in Bacillus subtilis activeren </em>, maar we ook overwegingen bespreken voor de toepassing van deze aanpak naar andere genetisch handelbaar bacteriën.

Introduction

Wij zijn geïnteresseerd in het begrijpen hoe de metabolieten die bacteriën afscheiden van invloed op de fysiologie en de ontwikkeling van naburige microben. Veel metabolieten zijn gekarakteriseerd op bioactieve effecten op andere microben. Twee goed beschreven voorbeelden omvatten antibiotica, die de groei van andere bacteriën remmen, en quorum sensing moleculen, die de globale genexpressie andere microben veranderen. Echter, bacteriën produceren vele andere kleine molecule natuurlijke producten die geen bekende bioactiviteiten ¹ hebben. Onze hypothese is dat bacteriën zijn geëvolueerd en bewaard de mogelijkheid om een ​​aantal van deze metabolieten omdat ze laten zij de cellulaire fysiologie van hun microbiële buren in het complexe microbiële gemeenschappen waarin meeste bacteriën bestaan ​​moduleren.

Bacillus subtilis celtypen

Wij hebben onze studies gericht op chemisch gemedieerde microbiële interacties die Bacil betrekkenlus subtilis. Dit is niet alleen vanwege zijn status als de Gram-positieve bacterie model en de daaruit voortvloeiende genetische tools beschikbaar voor de manipulatie ervan, maar ook vanwege zijn vermogen om te differentiëren in gekenmerkt celtypen. Voorbeelden omvatten cellen die: zwemmen, produceren de extracellulaire matrix die nodig is voor robuuste biofilmvorming, competent voor het opnemen van DNA uit de omgeving, en sporulerende onder andere ^2. Elk van deze celtypen expressie eigenschap transcriptionele regulon dat ze fysiologisch en / of fysisch verschillend van hun genetisch identiek siblings maakt. Onder vele groeiomstandigheden, meerdere celtypen samenleven als verschillende subpopulaties binnen een kolonie van B. subtilis cellen ^3. Hoewel veel soorten bacteriën analoog celtype heterogeniteit kunnen vertonen, dit fenomeen is bijzonder goed bestudeerd in B. subtilis.

In het bijzonder genen die zijn upregulated binnen elk van deze specifieke B. subtilis celtypen zijn geïdentificeerd. Identificeren van dergelijke genen opgereguleerd is essentieel voor het hier beschreven werk, omdat veel van deze microbiële fenotypes plaats moeilijk of onmogelijk direct waar te nemen. Bijvoorbeeld, we kunnen niet visueel een eigenschap detecteren zoals zwemmen op vaste (1,5%) agar platen, ook al is een subpopulatie van B. subtilis cellen produceren flagella onder die omstandigheden ^3. Een ander voorbeeld is biofilm matrix-productie. Matrix productie kan worden gevisualiseerd door kolonie morfologie (zo het resulteert in macroscopisch rimpelige kolonies), maar alleen op bepaalde groeimedium en na meerdere dagen groei ^4. Echter, door te weten welke genen opgereguleerd tijdens differentiatie, we kunnen transcriptionele reporters die als merkers voor cellulaire differentiatie in deze celtypes construeren.

Reporterconstructieproducten

Deze fluorescerende transcriptional reporters omvatten de promoters voor celtype specifieke genen besturen van de productie van een reportergen, bijvoorbeeld een fluorescerend eiwit. Voorbeelden zijn P _hag-YFP (voor het zwemmen cellen), P _TAPA-YFP (voor biofilm-matrix-producerende cellen), en P _SSPB-YFP (voor sporulerend cellen), waarbij P _x geeft de promotor regio voor gen-x. Deze reporter constructen geïntegreerd in een neutrale locus op chromosoom (figuur 1 en zie hieronder) zodat de natuurlijke regeling van het fenotype intact wordt gelaten. Echter, nu als een cel drukt dit fenotype, het drukt ook een fluorescerend eiwit. Dit zorgt voor een gemakkelijk gevisualiseerd uitlezen van de activering van bepaalde fenotypische gedrag, waardoor we het scherm voor microben die deze fysiologische respons te activeren. Hoewel dergelijke verslaggevers vaak worden gebruikt in de microbiologie, ze zijn niet in grote lijnen schermen om identif toegepasty metabole interacties tussen microben voordat deze methode werd beschreven ^5.

Er zijn een aantal belangrijke overwegingen bij het ontwerpen en bouwen van celtype-specifieke reporter stammen. Wij hebben uitsluitend transcriptionele fluorescente reporters gebruikt, hoewel andere soorten constructen zeker mogelijk. We ontmoedigen het gebruik van translationele fusies als merkers voor celtype differentiatie in ons scherm echter om twee redenen: 1) de wens om de natieve celtype-specifiek eiwit onverstoord verlaten, en 2) de erkenning dat een diffuse, cel- brede fluorescentie zal het makkelijker zijn op te sporen dan gelokaliseerde puncta binnen cellen (gemeen met translatiefusies).

Reportergen selectie

Na de beslissing om de transcriptie te gebruiken als een read-out, moet de reporter-gen worden geselecteerd (bijv. LacZ, fluorescentie, of luciferase). LacZ heeft het voordeel van de minst nodig specialeseerd materiaal te detecteren, maar er is een veel hogere waarschijnlijkheid van valse positieven onder milieu microben. In onze handen, het achtergrondniveau van Lac ⁺ organismen onder bodemmicroben was onbetaalbaar hoog (>> 10% van de bodem microben waren blauw (Lac ⁺⁾ op X-gal-platen; gegevens niet getoond). Het is mogelijk dat door titratie van de concentratie van X-gal in het medium, dit kan worden geoptimaliseerd om het gebruik van een X-gal reporter mogelijk, hoewel we dit niet geprobeerd. Luciferase met hoge gevoeligheid van detectie en de orthogonale reporter: er is bijna geen kans milieu microben inherent luminescerende. Toch vonden we het moeilijk om instrumenten te identificeren die onze instelling dat luminescentiedetectie toegestaan ​​over het hele Petri platen, zoals de meeste zijn ontworpen om alleen gelokaliseerde gebieden scannen in multi-well platen. Er kunnen ook complicaties visualiseren luminescerende kolonies op een wijze die ook toegestaan ​​gelijktijdige fysieke isolation induceren organismen. Hoewel het gebruik van vertrouwenspersonen kan dit mogelijk gemaakt hebben, we in plaats daarvan gekozen om fluorescerende transcriptionele verslaggevers, die zijn bewezen te werken in B. gebruiken subtilis, mits er afdoende gevoeligheid van detectie en lage valse positieve tarieven onder bodemorganismen, en mogen gebruiken van gemakkelijk beschikbare instrumentarium voor zowel visualisatie en isolatie procedures.

Fluorofoor selectie

De specifieke fluorofoor gekozen zal afhangen van uw bacteriën, agar groeimedium dat u gebruikt, en de specifieke fluorescentie filter stelt je beschikbaar hebt. Met onze instrumentatie, vonden wij dat zowel de B. subtilis kolonies zichzelf en de agar ze werden gekweekt op tentoongesteld minder achtergrond fluorescentie wanneer YFP (geel fluorescerend eiwit) filters werden gebruikt, het maken van die reporter superieur aan GFP (groen fluorescerend eiwit) in onze handen. Het codongebruik van fluorescente eiwittenvaak geoptimaliseerd voor eukaryoten, waardoor het belangrijk een fluorofoor ofwel bekend uit de literatuur te werken in bacteriën, of expliciet testen met een constitutieve promoter te selecteren. Een groot aantal steeds veranderende fluorescerend eiwit varianten beschikbaar ^6, die zijn beoordeeld in een aantal bronnen ^7,8, waarvan sommige leidraad uitdrukkelijk op het kiezen van een geschikt fluorescerend eiwit experiment ^9.

Promotor selectie

De keuze van een promotor zal grotendeels afhangen van uw mobiele type of fenotype van belang. Voor organismen zoals B. subtilis enkele celtype specifieke reporter genen in de literatuur vastgesteld. Voor andere bacteriestammen, onderzoekt microarray of transcriptie gegevens zal nodig zijn om informatie over welke genen in hoge mate gereguleerd onder de voorwaarden aan te bieden waar uw celtype van belang is gemanifesteerd. Een recente studie gecatalogiseerd de transcriptie van B. subtilis onder 104 verschillende groeiomstandigheden behulp tegelwerk microarrays ^10. Dit document geeft uitgebreide informatie over welke genen in hoge mate gereguleerd onder verschillende omstandigheden, die van onschatbare waarde is voor minder-goed gekarakteriseerd fenotypes.

In plaats van het in kaart brengen precieze promotor regio's voor elk gen van belang, we meestal gewoon gebruik maken van de reeks 200-500 bp stroomopwaarts van het gen als de promotor. De exacte volgorde lengte is afhankelijk van de genomische context: kortere gebieden worden gebruikt wanneer nodig om te voorkomen zowel stroomopwaarts coderende gebieden van aangrenzende open leesramen.

Neutrale loci en integratie

Hoe te handhaven de reporterconstruct in uw bacteriestam wordt de laatste vraag in het ontwerpen van een fluorescerende transcriptionele reporter stam. In bacteriën, worden genen van belang regelmatig onderhoudenop plasmiden antibiotische selectie. Echter, kan het niet mogelijk zijn om antibiotica te gebruiken tijdens coculture zonder het doden van de milieu-microben. Als plasmiden stabiel gehandhaafd in bacteriën, kan het mogelijk zijn de bacteriën groeien met een reporter-plasmide gedragen in aanwezigheid van antibiotica aan de reporter bereiden voor screening, en vervolgens elimineren antibiotica tijdens de co-cultuur zich in de hoop dat het plasmide zal voldoende gehandhaafd om voor fluorescentie. Echter, als plasmiden gemakkelijk verloren gaan in je bacterie, of verloren gaan onder stress omstandigheden, zal dit geen haalbare optie. In veel gevallen zal de beste oplossing voor de reporter construct geïntegreerd op het bacteriële chromosoom, die stabiele handhaving van de reporter kan zelfs in de afwezigheid van selectie. Om de integratie van de normale expressie of regulatie van uw gen van belang niet te verstoren, adviseren wij in een buitenbaarmoederlijke website integreren op het chromosoom dat can fungeren als een "neutrale locus." In B. subtilis deze integratie sites zijn genen die – wanneer veranderd – brengen een fenotype in bepaalde minimale media (waardoor integranten kunnen worden geïdentificeerd zonder antibioticum selectie), nog niet de groei of sporulatie prijzen in rijke media niet veranderen, en omvatten dergelijke genen als amyE, LACA, thrC, pyrD, gltA en saca (transporteren het vermogen om zetmeel te gebruiken, β-galactosiden, threonine, uracil, glutamaat en sucrose, respectievelijk) ^11-13.

Hoewel integratie in deze genen op betrouwbare wijze zijn gebruikt voor vele jaren B. subtilis (met name amyE en laca), kunnen soortgelijke kennis niet van genen in vele andere bacteriële soorten. Het gebruik van fagen hechtingsplaatsen zijn geweldig alternatief voor neutrale chromosoomintegratie websites: veel soortspecifieke ^14-16, alsook van de algemene integratie sites zoals de Tn7 aanhechtingsplaats (att Tn7) hebbengeïdentificeerd en gebruikt voor gen-inserties in vele bacteriesoorten ^17,18.

Milieu-microben

We maken gebruik van de bodem als een directe bron van milieu-microben voor onze coculture scherm. De bodem bevat een grote diversiteit aan microben, en veel van deze organismen rijke bron van natuurlijke producten. Door het gebruik van vloeibare suspensies van de bodem rechtstreeks op platen geplaatst met onze fluorescerende transcriptionele reporter stam (zonder voorafgaande isolatie van bacteriën uit de bodem), hebben we een aanzienlijke vereenvoudiging van de experimentele benadering. De bodem kan ofwel onmiddellijk na de oogst of bij -80 ° C voor toekomstig gebruik worden ingevroren. Onmiddellijk gebruik heeft het voordeel dat een grotere diversiteit aan microben potentieel kan worden gekweekt, ook die welke niet overleeft goed bevriezen. Het nadeel dat de concentratie van kweekbare bodemleven uit deze monsters onbekend is, waardoor het aantal scherm platen die worden gebruikt. Delayed gebruik heeft het voordeel dat de cfu / ml voor elke bron bodem vooraf kan worden bepaald, waardoor een optimale aantal kolonies worden gekweekt op elke zeefplaat. Het vereist echter dat de bodem organismen bestand zijn tegen bevriezing.

Merk op dat diversificatie van de inductor zwembad wordt onderzocht (dwz de bodem bronnen) lijkt effectiever te zijn op nieuwe interspecies interacties te identificeren dan een grondige screening op dezelfde grond: grotere fylogenetische diversiteit werd waargenomen in de klappen die in onze matrix-inductie scherm extra bodem bronnen werden onderzocht in plaats van screening dezelfde grond bronnen grondiger (EA Shank en R. Kolter, Harvard Medical School, niet gepubliceerde resultaten).

Overzicht

De hier beschreven benadering is eenvoudig qua technische eisen. Het gaat om: 1) het construeren van een fluorescerende transcriptionele reporter in B. subtilis of eenandere bacteriële species plaats, 2) het identificeren van voorwaarden waaronder de reporter niet geactiveerd is, 3) het bereiden van porties van deze reporter stam en organismen worden gescreend (in ons geval de bodem, maar andere bronnen kunnen worden gebruikt in plaats), 4) het mengen van deze twee microben op vaste media, 5) het identificeren en isoleren vermeende inducerende organismen, en 6) bevestigt dat deze organismen inderdaad dit fenotype in een secundaire screening kan activeren. Eenmaal geïdentificeerd, deze organismen en hun metabolieten geven ons met chemische hulpmiddelen om bacteriële gedrag te moduleren, om bacteriële fysiologie en microbiële interacties te bestuderen, en om potentieel fungeren als nieuwe steigers voor toekomstige therapeutische verbindingen.

Protocol

1. Selecteer een Reporter Gene en Construct een TL Transcriptionele Reporter Voor B. subtilis: Zie de Jupiter artikel in referentie 19 voor een protocol beschrijft de bouw van fluorescerende transcriptie verslaggevers in Bacillus subtilis. Voor andere bacteriesoorten: Vaststellen van een gen dat wordt gereguleerd tijdens de fysiologische reactie plaats. Dit kan worden gebaseerd op bestaande liter…

Representative Results

Dit scherm werd gebruikt voor bodemorganismen identificeren afscheidende verbindingen die de fysiologie van B. veranderen subtilis. De hier beschreven resultaten richten op de matrix producerende cel type B. subtilis, die de eiwitten en exopolysaccharideproduktie die nodig zijn voor robuuste biofilmvorming in deze bacterie produceert. Wij selecteerden de promotor van het TAPA-sipW-TASA operon voor onze fluorescerende reporter construct (P TAPA-YFP). Dit operon code…

Discussion

Een van de inherente beperkingen van dit protocol is doordat het op de cultivability van microbiële organismen. Zoals is goed gedocumenteerd ²⁴ meeste microbiële leven op aarde kan (nog) niet worden gekweekt onder kweekomstandigheden onderzocht om date. Zo zal een groot aantal interacties tussen micro-organismen die zich voordoen in een natuurlijke omgeving onopgemerkt gebruik van deze aanpak. Aangezien onze wens is om niet alleen te identificeren waarin dergelijke wisselwerkingen, maar bestuderen ook mecha…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.