建立了外科手术引起的小鼠模型，以调查的progranulin在骨性关节炎的保护作用

Summary

我们描述了一个协议内侧半月板（DMM）模型小鼠中，一种有效的工具，骨关节炎（OA）研究的不稳定。此外，我们已经证明progranulincan夸大OA的发生和发展利用该模型的不足，表明progranulin的发挥在OA的发病机制中起保护作用。

Abstract

内侧半月板不稳定（DMM）模型是研究在骨关节炎（OA） 在体内的致病众多的关节炎相关分子的病理生理作用的一个重要工具。然而，详细的，尤其是可视化协议，用于在小鼠体内建立这种复杂的模型，无法使用。在此我们利用野生型和progranulin的（PGRN）的 - / - 小鼠为例子来介绍一种协议，用于诱导DMM模型小鼠，与OA相比下成立了这个手术引起的模型的发作。在老鼠身上进行的操作要么假手术，这只是开了关节囊，或数字万用表操作，这将削减MENISCO，胫骨韧带，造成内侧半月板不稳定。用组织学检测（ 如番红O染色），办公自动化相关基因的表达，降解软骨细胞外基质分子和骨赘骨关节炎形式严重性进行评估通报BULLETIN。 DMM操作成功诱导的OA发生和发展中都野生型和PGRN-/ - 小鼠，并导致了在此手术诱导模型更严重的表型OA PGNR生长因子损失。

Introduction

骨关节炎（OA），也称为退行性关节炎，影响到世界人口的15％，超过46万人在美国，并且其特征在于滑膜炎，软骨变性和骨赘形成^1。它可以是遗传，代谢，生物力学和生化因素之间复杂的相互作用的结果。 OA的基本机制继续回避科学界。目前有许多动物模型中，可以模仿OA ^2,3的发病机制。它建立各种转基因小鼠的两个可用性和实验的成本效益，因为动物模型小鼠中是很重要的。其中各种不同的实验OA模型中，手术引起的内侧半月板（DMM）模型的不稳定是由于其良好的重现性和OA的发展过程中一个相对进展较慢一个广为接受的OA模型。这两个属性有是关键的不同处理或转基因^3-8 OA进展的评估。然而，外科手术的OA模型的一致性在外科手术，其结果是受多种因素影响，手术小鼠模型中的应用是有限的。

的progranulin（PGRN）是表示在各种细胞多功能生长因子。它是已知的PGRN起着各种生理和疾病过程，如伤口愈合^9，肿瘤¹⁰和炎症^11-15的关键作用。研究还表明，PGRN的不足可引起神经系统的退化性疾病在人类和小鼠^16-18。它是已知的PGRN表达在人关节软骨，其水平是在患者的骨关节炎和类风湿关节炎的¹⁹软骨显著升高。此外，PGRN也起着软骨细胞增殖^20，分化和软骨内至关重要的作用生长板的发育^21,22

Protocol

所有与动物的外科手术应该由本地机构的动物护理和伦理委员会，以尽可能避免疼痛而造成手术的不适努力的批准。

1。准备

1. 选择8-12周龄雄性C57BL / 6小鼠体重手术约25g。
2. 通过腹膜内注射含有甲苯噻嗪（5毫克/千克）和氯胺酮（40毫克/千克）鸡尾酒的麻醉动物。
3. 剃须膝盖用剃刀，然后手术悬垂的动物和消毒手术部位用优碘和酒精（3次）并覆盖鼠标眼睛软膏。

2。手术过程

1. 做1厘米的纵向段内侧髌切口，显露膝关节。
2. 通过髌骨和髌韧带外侧脱位轻轻打开膝关节。
   1. 切开膝关节囊纵向通过段内侧髌切口在步骤2.1。
   2. 解剖膝关节囊用钳子。
   3. 抓住后爪与左手的远端部分，并执行髌骨和髌韧带与钳的横向错位。按住后爪轻轻的，并确保避免在爪子创伤。关节囊被解剖越好，越少力将被要求作出的错位。
3. 操作过程中滴落的关节软骨的表面上的无菌盐水中，以避免干燥出软骨表面。
4. 切入内侧meniscotibial韧带其中锚内侧半月板的胫骨平台。避免伤及内侧半月板下方的软骨。
   1. 确定内侧半月板股骨内侧髁和内侧胫骨平台之间的定位。
   2. 确定meniscotibial韧带是连接内侧半月板外侧与胫骨髁间嵴。
   3. 抱喜ND爪子轻轻的....

Results

成功建立了小鼠DMM模型，PGRN的缺陷夸大手术引起的OA发展。

老鼠-深水和数字万用表操作（ 图1）WT和PGRN-/执行了。操作8周后，处死小鼠，并番红O染色对从膝关节的部分来进行，随后关节炎得分基于组织学的统计分析。 如图2A所示 ，有软骨的基于番红O染色，这暗示了类似的基线情况（上图），没有明显的退化在两个基因型在假手术组。 8周后数字万用表操作（下图），有蛋白多糖及破坏软骨结构的WT和PGRN-/（亏损） - 小鼠（红色箭头）。两个蛋白多糖和软骨退化的损失表明成功诱导的OA中的表型。 indicat列的条编下面的数字万用表操作组内成员之间的变化。然而，杆比较短，并且PGRN击倒显示更高损耗蛋白多糖和软骨结构进行了更严重相比于野生型品种摧毁。此外，进行如先前所述²⁵软骨得分的统计分析，以及软骨得分显著高于PGRN基因敲除比WT组。我们的研究结果表明，PGRN的损失导致更严重的表型的OA。

Discussion

据报道，小鼠的品系是非常重要的DMM模型诱导，小鼠作为不同菌株有不同的OA严重性DMM后，用在129/SvEv应变水平最高，其次是C57BL6，129/SvInJ然后FVB / ^Ñ26。转基因的一大部分是建立在C57BL6小鼠，如PGRN-/ - 小鼠，我们在本研究中使用，这是相对容易的DMM。然而，如果转基因是基于不敏感的菌株如FVB / N小鼠，它是必要的回交这些小鼠与DMM诱导前敏感菌株。用于数字万用表诱导小鼠的性别也是非常重要的，因为研究已经表明，雌性小鼠比雄性小鼠²⁷不太敏感。此外，小鼠的年龄数字万用表操作变化从8周龄根据文献^29，这也扮演在OA的发病机制中发挥关键作用12周龄。因此，相同年龄的小鼠应被操作以消除这种影响。手术后疼痛控制是必需的，以提高手术后的小鼠的运动。由于DMM模型通过运动介导的磨损和撕裂的软骨，运动不足导致OA的手术后疼痛的结果可能会导致OA的发展不一致。目前没有关于关于是否删除内侧半月板^4,28数字万用表的定义存在差异。在我们的研究中，我们仅仅是不稳定的内侧半月板，但没有将其删除。在数字万用表型号病变主要位于在胫骨.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
No. 10 手术刀片	Feather	25-2976#10
6-0 缝合	Applied Dental	WG-N53133