Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop

Summary

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Abstract

Wir beschreiben die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und Differentialinterferenzkontrastbildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. NIQPM auf einem vereinfachten Modell der Wellenausbreitung auf der Basis, der sogenannten paraxialen Näherung mit drei zugrunde liegenden Annahmen: niedriger numerischer Apertur (NA) Beleuchtung, Schwach Streuung, und schwache Lichtabsorption durch die Probe. Glücklicherweise ungefärbten zellulären Proben erfüllen diese Annahmen und niedrigen NA Beleuchtung ist leicht zu kommerziellen Mikroskopen erreicht. HTDIC wird verwendet, um Informationen von Volumendurch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Aufhellung erhaltenation Bedingungen. Hohe NA Beleuchtung ermöglicht verbesserte Schneide der Probe entlang der optischen Achse. Hilbert-Transformationsverarbeitung auf der DIC Bildstapeln stark erhöht Kantenerkennungsalgorithmen für die Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Erreichbarkeit mit "off-the-shelf"-Mikroskope. Es gibt zwei grundlegende Einschränkungen dieser Methoden: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf gewerbliche Bereiche hebt derzeit die Untersuchung von Phänomenen schneller als 1 Bild / Minute, und zweitens, Beugungseffekte beschränken den Nutzen der NIQPM und HTDIC, um Objekte von 0,2 bis zu 10 (NIQPM) und 20 (HTDIC) um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden zu ermöglichen. Aufregend, die meisten Fest cellular Proben leicht mit diesen Methoden untersucht.

Introduction

Die Verwendung optischer Mikroskopie ist nun überall in der Untersuchung von zellulären Organismen. Aufgrund ihrer geringen endogenen Absorption und schwache Streueigenschaften über den sichtbaren Lichtspektrum, ich Zellen nicht stark auf die Amplitude der Lichtwellen durchqueren sie und erscheinen halbtransparent, wenn sie mit Standard-Hellfeld-Mikroskop abgebildet. Zellproben haben jedoch verlangsamen optischen Wellen, die sich durch sie in einer Weise, die linear zur Höhe der lokalen Massendichte in einem bestimmten Raumbereich, durch den das Licht in Beziehung steht. Die Nutzung dieser heterogenen Zeitverzögerung oder "Phase"-Profil von optischen Wellen durch mikroskopische Präparate übertragen wurde erstmals 1935 von Frits Zernike ¹ beschrieben und experimentell durch Zernikein 1942 ² realisiert. Zernike den Nobelpreis im Jahr 1953 für diese Leistung ausgezeichnet. Zeiss kommerzialisiert dieses Instrument im Jahr 1945 ^3. Im Jahr 1955, Smith und Nomarskich würde ihre ersten Arbeiten über die Verwendung ⁴ und ⁵ von Theorie Differentialinterferenzkontrast (DIC) Mikroskopie, eine Modalität, die die räumliche Gradienten von Phase als Kontrastmechanismus verwendet zu präsentieren. DIC wurde von Zeiss in 1965in enger Zusammenarbeit mit Nomarski ⁶ kommerzialisiert. Im Jahr 1981 zeigten zwei Labors die erste aufgezeichnete Live-Cell-DIC Bilder mit dem Einbau von Videokameras in die Optik Zug der DIC-Mikroskop ^{7, 8.} Die Ära der Live Cell Imaging war geboren.

Seit dieser Zeit hat sich die Ausführung der beiden Phasenkontrast und DIC auf kommerziellen Mikroskope weitgehend unverändert geblieben. Diese Methoden werden hauptsächlich von Biologen genutzt werden, um Bilder von Zellen für qualitative Zwecke zu produzieren: Überwachung der Morphologie, Tracking subzellulärer Strukturen, und Untersuchungen von Membrandynamik ^9. Diese Techniken sind in ihrer qualitativen "off-the-shelf"-Konfiguration und Phase DIC lassen sich beliebige Funktionen der Intensität der Lichtquelle, die Beleuchtungsoptik Einstellungen und CCD-Kamera Verstärkung, Gamma-und Belichtungseinstellungen.

Eine kleine Legion von Physikern und Ingenieuren optischen hat sich bemüht, zu kommerziellen bildgebenden Verfahren quantitativ. Zu den ersten Bemühungen waren zwei Briefe an die Natur in 1952 und 1953, in denen der Arzt-turned-Biophysiker Robert Barer demonstriert die Verwendung von Phasenmikroskopie, um Zelltrockenmasse von Zellen durch Schätzung Phasenverschiebungen durch diesen Zelltypen mit einem handelsüblichen Phasen Mikroskop bestimmen ^{10, 11.} Phasenmikroskopie ^10,11, DIC-Mikroskopie ^{12-17, 18-22} und Hellfeld auf optische Weglänge, Phase, Masse zu bestimmen: Das Feld hat eine Vielzahl von Techniken in den folgenden Jahren auf Basis drei Grundmarkierungsfreie Kontrastmechanismen entwickelt Dichte, Brechungsindex, und Zellvolumen.

In Abs.llel, eine große Sammlung von kundenspezifischen optischen Instrumenten wurden auch seit den 1950er Jahren entwickelt worden und haben weitreichende optische Messungen im Bereich von Anwendungen in der Parasitenwachstum ^23, zu dokumentieren, die den Zellzyklus ²⁴ bis sucht Membrandynamik der roten Blutzellen ^25. Insbesondere hat die vergangenen zehn Jahren eine Fülle von kennzeichnungsfreien quantitativen Mikroskopie in Form von Beugungsphasenmikroskopie ^{26, 27} tomographischen Phasenmikroskopie, digitale holographische Mikroskopie ^28, phasensensitive optische Kohärenzmikroskopie ^29, räumliche Lichtinterferenzmikroskopie ^30. Hilbert gesehen Phasenmikroskopie ³¹ und quantitative Phasenmikroskopie ^32. Trotz ihrer gemeinsamen Erfolge, haben diese Instrumente nicht zu den größeren Bereich der biologischen Forscher durch, meist, um ihre komplexen Mess-und Rechenanforderungen verbreitet.

Hier beschreiben wir dEscribe die Verwendung eines Lichtmikroskops, quantitative Messungen der Masse, Volumen und Dichte auf die zelluläre Proben durch eine Kombination von Hellfeld-und DIC Bildern durchzuführen. Zwei Hauptansätze werden vorgestellt: noninterferometric quantitative Phasenmikroskopie (NIQPM), Messungen der Gesamtzellmasse und subzellulärer Dichteverteilung durchzuführen, und Hilbert-Transformation Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (HTDIC), um die Lautstärke zu bestimmen. Die Hauptvorteile von NIQPM und HTDIC lag in ihrer technologischen Zugänglichkeit. Die für die erfolgreiche Ausführung erforderlich Abbildungsbedingungen sind im Rahmen des normalen Betriebs der meisten kommerziell erhältlichen Mikroskope. Darüber hinaus sind die Post-Processing-Algorithmen stabil, schnell und robust – worden in MATLAB mit Hilfe von schnellen Fourier-Transformation (FFT) basierte Algorithmen, wann immer möglich umgesetzt.

NIQPM ist eine Methode zur Phasen-und den axial integriert Massendichte cel rekonstruierenzellulären Proben von Hellfeld-Bilder. Summation dieser axial integrierten Massendichte über die Fläche der Probe gibt die Gesamttrockenmassegehalt der Probe. , In dem sie gezeigt werden, dass die Phasenprofil einer Zelle konnte von durch-Fokus-Hellfeldbildern der Probe rekonstruiert werden – – Die NIQPM Protokoll basiert auf den experimentellen Grundlagen von Paganin und Nugent ^{18, 19} aufgestellt hat und die theoretische Arbeit von Frank , Altmeyer und Wernicke ²⁰ – auf die Lösung der paraxialen Wellen Modelle in einer effizienten FFT-basierte Weise. Die Verbindung der Phase auf die Trockenmasse Dichte beruht auf der Arbeit von Barer ^{10, 11} und ³³ Popescu basiert.

Volumen Informationen können durch Fokus DIC Bilder unter hohen NA Beleuchtungsbedingungen, die optische Schnitte der Probe entlang der optischen Achse zu ermöglichen, erhalten werden. Hilbert-Transformation Verarbeitung der DIC-Bildstapeln stark erhöhtRanderfassungsalgorithmen zur Lokalisierung der Probe Grenzen in drei Dimensionen durch die Trennung der Grauwerte der Probenintensität von denen der Hintergrund. Diese Arbeit stammt mit Arinson et al. ^34. obwohl wir beide Fourier-Filter-Methoden eingeführt, um den Kontrast und einen Sobel-Kantenerkennung basierend Verfahren zur automatischen Volumen Analyse der Probe zu verbessern. Wir haben auch bestätigt HTDIC vorher für Polystyrolkugeln in der Größe von der Beugungsgrenze von bis zu 20 um Durchmesser ^36.

Während sowohl NIQPM und HTDIC technologisch erreichbar aufgrund ihrer Entwicklung zu kommerziellen Mikroskope sind die Verfahren im wesentlichen durch die Hardware-Konfiguration der Mikroskope selbst begrenzt. Die primären Grenzen dieser Techniken sind zweifach: langsam Z-Stapel-Erfassungszeit auf kommerziellen Bereiche, die durch Übersetzung der gesamten Probenbühne im Gegensatz zu nur die ObjektivlinseBegrenzt gegenwärtig die Untersuchung von Phänomenen schneller als etwa 1 Bild / min und zweitens Beugungseffekte begrenzen die Nützlichkeit NIQPM und HTDIC auf Objekte in der Größe von 0,2 bis 10 und 20 um im Durchmesser sind. Daher muss die Probe und die damit verbundenen Zeitdynamik von Interesse bestimmte Größe und zeitliche Einschränkungen treffen, um die Anwendung dieser Methoden auf typische "off-the-shelf" Instrumente zu ermöglichen. Spannend, die meisten festen zellulären Proben leicht mit diesen Methoden untersucht.

Eine Übersicht über den NIQPM und HTDIC Protokolle sind in Fig. 1 angegeben. In Abbildung 2 veranschaulichen wir optimale und suboptimale Durch Schwerpunkt Bildgebung unter niedrigen und hohen NA Beleuchtungsbedingungen sowohl für Hellfeld-und DIC-Bilder. Abbildungen 3 und 4 zeigen die Abhängigkeit der Parameter NIQPM Algorithmus auf der erfolgreiche und nicht erfolgreiche Implementierungen. <strong> 5 veranschaulicht die Schritte in der HTDIC Bildverarbeitungs-Algorithmus beteiligt und zeigt die optimale Implementierung des Algorithmus, um Zellvolumen zu bestimmen.

Protocol

1. Mikroskop Technische Daten Zur Durchführung Bildgebung in der richtigen Art und Weise das Mikroskop sollte den folgenden Spezifikationen: Besitzen beide Differentialinterferenzkontrast (DIC) und Hellfeld (BF) Kontrast. Haben Computer-gesteuerten z-Achsen-Bewegung. Haben Sie eine verstellbare Blende, um die Sammellinse numerische Apertur variieren. Eine Öffnung mit einer abgestuften Regel oder elektronische Auslesung erforderlich ist, um den Wert der numeri…

Representative Results

Korrekte Probenbeleuchtung während durch Fokus-Bildaufnahme ist entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung des NIQPM nd HTDIC Algorithmen. In Abbildung 2 veranschaulichen wir niedrigen und hohen NA Beleuchtung sowohl unter DIC und Hellfeld-Kontrast für eine Polystyrol-Kugel und der menschlichen kolorektalen Adenokarzinom-Zelllinie SW620. Fig. 2A, 2C, 2I, 2K und demonstrieren eine optimale Bildgebung für NIQPM. 2F, 2H, 2N und 2P demonstrieren optima…

Discussion

Im allgemeinen ist NIQPM ein beugungsbegrenzter Technik auf optische Weglängen zwischen 0,25-44,7 validiert. Validierung auf n = 1.596 durchgeführt Polystyrolkugeln im Durchmesserbereich von 0,11 bis 9,8 &mgr; m in Fluoromount G suspendiert (Daten nicht gezeigt). Zellen besitzen optischen Weglängen, die von fast 0-7 liegen.

Bei der Messung der Dichteverteilung einer Probe kann man feststellen, dass die Pseudo-Bild DIC sieht gut aus, während die Dichtekarte besitzt unerwünschte Hinte…

Materials

Zeiss Axio Imager 2 microscope	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany	Axio Imager D2	Microscope
Green filter (λ = 540 ± 25 nm)	Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont	D540/25x	Green filter
SlideBook 5.5 software	Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado		Image acquistion software
Polystyrene microspheres	Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN	PS06N	Polystyrene spheres
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	0100-01	Mounting media