Summary

Isolamento e cultura de células endoteliais da Embryonic posencéfalo

Published: January 23, 2014
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Summary

Este vídeo demonstra uma estratégia fácil e confiável para a preparação de culturas puras de células endoteliais do cérebro anterior embrionário dentro de 10-12 dias e será útil para a pesquisa focada em muitos aspectos da angiogênese cerebral.

Abstract

Células endoteliais cerebrais embrionárias podem servir como uma ferramenta importante no estudo da angiogênese eo desenvolvimento neurovascular e interações. As duas redes vasculares do cérebro anterior embrionário, pial e periventricular, são espacialmente distinta e têm diferentes origens e padrões de crescimento. As células endoteliais das redes vasculares pial e periventriculares têm perfis de expressão de genes únicos e funções. Aqui apresenta-se um protocolo de passo-a-passo para o isolamento, a cultura, e a verificação de populações puras de células endoteliais a partir da rede vascular periventricular (PVECs) do prosencéfalo embrionário (telencéfalo). Nesta abordagem, telencéfalo desprovido de membrana pial obtido a partir do dia embrionário 15 ratinhos é picada, digeridos com colagenase / dispase e disperso mecanicamente numa suspensão de células individuais. PVECs são purificados a partir de suspensão de células utilizando selecção positiva com anticorpo conjugado com MicroBeads anti-CD-31/PECAM-1 usando um forte magnéticométodo de separação. Células purificadas são cultivadas em colágeno 1 revestidas placas de cultura em meio de cultura de células endoteliais, até que se tornar confluentes e mais subcultivadas. PVECs obtidos com esta exposição de paralelepípedos protocolo e fenótipos fusiformes, visualizadas por microscopia de luz de contraste de fase e microscopia de fluorescência. Pureza de culturas PVEC foi estabelecida com marcadores de células endoteliais. Em nossas mãos, este método confiável e consistente produz populações puras de PVECs. Este protocolo irá beneficiar estudos para obtenção de conhecimentos mecanicistas em prosencéfalo angiogênese, compreender as interacções PVEC e transversais conversações com os tipos de células neuronais e tem um enorme potencial para a angiogênese terapêutica.

Introduction

A angiogênese, neurogênese e migração neuronal são eventos críticos no sistema nervoso central (SNC) de desenvolvimento, reparo e regeneração. Vários estudos elegantes mostraram que células endoteliais estimular a proliferação neuronal e vice-versa através da liberação de fatores solúveis e pelo contato direto. Descobrimos que é curioso que na maioria dos estudos 1-3, enquanto progenitoras neuronais / células estaminais neurais são isoladas a partir do cérebro embrionário, que são co-cultivados com células endoteliais do cérebro adulto, outras fontes de tecido adulto, ou com linhas de células endoteliais. Isto pode em parte ser devido aos problemas técnicos associados com o isolamento e cultivo de populações puras de células endoteliais do cérebro embrionário. No entanto, a angiogénese, a neurogénese e migração neuronal são eventos que ocorrem em simultâneo, em ordens de magnitude mais robusto no cérebro embrionário do que no cérebro adulto normal. A rede vascular periventricular do embryonic prosencéfalo (telencéfalo) origina a partir de um navio localizado no primórdio gânglios basais e desenvolve-se na forma de um gradiente de ordenada ventral dorsal telencéfalo por dia embrionário 11 (E11), 4,5. Este plexo de vasos da rede vascular periventricular são distintos dos vasos pial com base em origens, localização anatômica, os padrões de crescimento e regulação do desenvolvimento 4,5. A direção de propagação do gradiente angiogênese periventricular corresponde ao gradiente neurogenético transversal telencefálico. Dentro do telencéfalo, o gradiente de angiogénese periventricular e o gradiente de neurónios GABA migram tangencialmente sobrepõe espacialmente assim 6. No que diz respeito ao tempo, a inclinação da angiogénese é, antes da inclinação e do neurónio GABA gradiente neurogenético por cerca de um dia. Assim, as células endoteliais periventriculares são espacialmente e temporalmente bem posicionada para fornecer pistas importantes para apoiar a neurogênese e telencefálico4,6 migração neuronal. Portanto, o uso de células endoteliais periventriculares embrionárias em experimentos de co-cultura com células progenitoras e / ou neurônios neuronais forneceria um modelo mais favorável para o estudo de interações neurovasculares e desenvolvimento de novos caminhos para o tratamento de doenças neurodegenerativas ou da lesão cerebral isquêmica / traumático.

Ressaltamos a importância de remover a membrana pial, não só para limitar a contaminação de células epiteliais, mas também para separar as células endoteliais pial que são molecularmente e funcionalmente distinto de células endoteliais da rede vascular periventricular 4,6 (PVECs denominado para distinguir de pial ECs) . Aqui, descrevemos o método que usam rotineiramente em nosso laboratório para obter um rendimento rico e puro de PVECs. Estas células endoteliais são preparados a partir de prosencéfalo embrionário isolado a partir de um único rato cronometrado-grávida. Eles podem ser expandidas, subcultivadas e congelado para baixo com êxito para utilização futura.

Protocol

1. Preparação de reagentes e soluções Revestimento de 35 mm de prato de cultura: O colagénio tipo 1 solução é fornecida como uma solução aquosa de ácido acético 20 mM (~ 100 mg de proteína / tubo de ensaio). Dilui-se um volume adequado de solução de colagénio a uma concentração de trabalho de 0,01% a partir da cultura de tecido estéril, de grau água. Pratos de revestimento com 1 ml de solução de colagénio durante 3-4 horas à temperatura ambiente (TA) ou a 37 ° C, ou durante a noite a …

Representative Results

A caracterização fenotípica dos PVECs do dia 1-12 é mostrado por microscopia óptica de contraste de fase (figura 2). As células ligadas ao prato no dia 1 mostra a morfologia característica de divisão celular (Figura 2A). Entre 5-8 dias, PVECs transição de pedra de calçada ao fuso morfologia em forma típica de células endoteliais e mais parecido com o seu estado in vivo (Figuras 2B e 2C). Por volta do dia 12, a cultura atinge PVEC c…

Discussion

PVEC do são mais fisiologicamente relevante do que as células endoteliais adultas do cérebro e células endoteliais provenientes de outras fontes de tecidos para estudos sobre interações neurovasculares e também têm potencial terapêutico. Para a preparação PVEC, é princípio fundamental com dissecção de trabalhar rápido para conseguir uma boa viabilidade desde as células mortas pode ligar de forma inespecífica a MicroBeads CD31. Além disso, se a suspensão de uma única célula não é conseguido antes …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por uma Aliança Nacional para a Pesquisa sobre Esquizofrenia e Depressão (NARSAD) Young Investigator Award e National Institutes of Health conceder R01NS073635 a AV.

Materials

DNase I Sigma D-4527
Collagen, Type 1 solution from rat tail Sigma C3867
DPBS Quality Biologicals 114057-131
EDTA Fisher Scientific M4055
BSA Sigma A2058
MS column Miltenyi Biotech 130-042-201
CD31 microbeads Miltenyi Biotech 130-097-418
MACS separator Miltenyi Biotech 130-042-102
MACS multi stand Miltenyi Biotech 130-042-303
Cell strainer 70 µm BD Bioscience 352350
Antibiotic and antimycotic solution Sigma A5955
FBS Sigma F4135
Collagenase/Dispase Roche 10269638001
DMEM Lonza 12-604F
35 mm culture dish BD Bioscience 353001
15 ml falcon tube BD Bioscience 352097
50 ml falcon tube BD Bioscience 352098
ECCM kit BD Bioscience 355054 Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor
Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) BD Bioscience 354006
RBECGM Cell applications R819-500
DMEM F12 Life Technologies 10565-018
glutamax Life Technologies 305050-061
tissue culture grade water Life Technologies 15230162
0.25% Trypsin Life Technologies 15050
Soyabean trypsin inhibitor BD Bioscience 5425
Matrigel BD Bioscience 354234
Qtracker 655 Cell Labeling Kit Life Technologies Q25021
CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 Life Technologies C10608
Biotinylated Isolectin B4 antibody Sigma L2140
Anti-Von Willebrand factor Sigma F3520
Anti-CD31/PECAM-1 BD Pharmingen 550274
Vectashield Hardset Mounting media with DAPI Vector Laboratories H-1500
Ketamine Butler Schein Animal Health Supply 44028
Xylazine Lloyd Laboratories 1009
Stereomicroscope Motic SMZ-168
hemocytometer Fisher Scientific 267110
inverted microscope Olympus CK-40 CK-40
Flouroscent microscope Olympus FSX-100 FSX-100
Fine forceps Roboz surgical instrument 7 inox
Fine microtip scissors Roboz surgical instrument RS5611

References

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Cite This Article
Kumar T., P., Vasudevan, A. Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain. J. Vis. Exp. (83), e51021, doi:10.3791/51021 (2014).

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