精子形成細胞学的分析：ライブとの固定の準備<em>ショウジョウバエ</em>精巣
Summary
単離および位相コントラストおよび蛍光顕微鏡によって撮像するためのショウジョウバエ精巣サンプル（ライブおよび固定）の製造方法は、本明細書に記載されている。
Abstract
キイロショウジョウバエは、広く様々な生物学的プロセスを解明するために使用されている強力なモデル系である。例えば、 ショウジョウバエの雌雄生殖系の両方の研究は、現在の減数分裂の理解だけでなく、幹細胞生物学に大きく貢献しています。優れたプロトコルは、 ショウジョウバエの卵巣と精巣3月12日の単離およびイメージングのための文献で 利用可能です。ここでは、顕微鏡分析のための切開およびショウジョウバエ精巣の調製方法は、添付のデモビデオで説明されています。成人男性の腹部から精巣を単離し、蛍光顕微鏡による分析のために精巣を固定し、免疫染色のために位相差顕微鏡ならびにプロトコルによる分析のために生きている組織のスライドを調製するためのプロトコルが提示される。これらの技術は、dは示すショウジョウバエの変異体の特徴付けにも適用することができる精子形成においてだけでなく、タンパク質の細胞内局在を可視化する中efects。
Introduction
ショウジョウバエの精巣は、幹細胞の調節、減数分裂および精子の開発13-18を含む多くの生物学的プロセスの研究のための理想的なモデル系である。精母細胞とその減数分裂のスピンドルは精子形成の間に大規模なので、細胞学的分析のための便利な、リラックスした細胞周期チェックポイントである細胞周期遺伝子の変異の研究を促進する。異なる細胞型は、精巣の長さに沿って順序付けられた進行において観察することができ、精子形成を中断させるが、この全体的な配置に変化をもたらすことができる。 ショウジョウバエの遺伝学的ツールと組み合わせ、これらの機能は、精子形成21〜23の変異解析を容易にした。
ショウジョウバエの精子形成の段階は明確に定義されています。嚢胞内で同期開発の生殖系列細胞は精巣の長さに沿って精子形成の段階を経て順次進行する。 BOの間に雄の生殖細胞の有糸分裂と減数分裂番目、細胞質分裂が娘細胞がリング運河（ 図1）として知られている細胞質の橋で接続されたままである不完全な発生します。精巣の先端チップは、一次精母細胞の16細胞嚢胞を生成するために、不完全な細胞質分裂で4糸分裂を経る精原細胞に生じる生殖細胞系列幹細胞の集団が含まれています。減数分裂前S期の後、一次精母細胞はG2、〜25倍〜90時間の間に細胞容積の増加に長期の成長期に入る。二次精母細胞とそれぞれ半数体精子細胞の64細胞嚢胞の32細胞嚢胞の形成における減数分裂Iおよび減数分裂IIの結果を通じて進行。未熟、円形精子が成熟精子を形成するために、広範な細胞リモデリングを受ける。減数分裂後の細胞は、伸長のバンドルと成熟した精子細胞、特に、精巣の容積の大部分を占める。
T女性のハエに対する機能精子の彼の成功の輸送は、いくつかの対になった構造（精巣、精嚢、および付属腺）および単一射精管で構成されている男性生殖器系、（ 図2）の異なる部分間の調整が必要になります。精子は、精巣内で生産され、交尾24まで精嚢内に格納されます。付属腺は、精液を生産分泌細胞が含まれています。精嚢からの移行精子精嚢および付属腺の両方に接続されて射精管、内の精液と混合される。精子と精液のこの混合物は、最終的には雄雌の腹部25の後方端部に配置射精バルブを介してフライの膣内に雄から排出される。精液中のタンパク質は、REPにspermathecaの複数形と呼ばれる特殊な器官内で精子の長期保管のために必須であるショウジョウバエのメス26のroductiveトラクト。
ショウジョウバエの精巣の単離および精子形成の様々な段階での細胞の可視化のための優れた方法は、科学文献3月12日で利用できます。私たちは、ここに添付のビデオデモで、これらのプロトコルの例を提示することによって、知識のボディに追加します。位相差顕微鏡のための生精巣試料の調製のためのプロトコールは、以前に記載された方法27に基づいている。ホルムアルデヒド固定および精巣の免疫染色のためのプロトコルは、先に説明した方法28に基づいています。本明細書に記載されるアプローチは、 ショウジョウバエの精子形成（例えば、ダイニンの役割を評価するために、 ショウジョウバエの精子形成中のマイナス端指向性微小管モーター）の多くの研究で使用されてきた。
基本的なプロトコルに加え、提案がvaryinために提供されG解剖精原細胞、精母細胞、または成熟精子を濃縮するようになっている。嚢胞がそのまま残るか、必要に応じて破壊さどちらように精巣を処理するための異なる方法が記載されている。モデル系としてショウジョウバエ精巣を使用する利点は、 ショウジョウバエの卵母細胞および胚と比較して、抗体および色素が容易に精巣からの分散次の細胞に浸透することができ、より少ない洗浄ステップが必要とされる、ということであるため、プロトコルは、比較的に行うことができる短い時間。
Protocol
Representative Results
Discussion
野生型のハエの精巣は、容易に、それらの黄色（これとは対照的に、隣接する白の組織）に識別することができますが、 白の変異型ハエの精巣は白であり、従って、時折、腸と混同することができます。 P-エレメントで見つかったミニ白遺伝子が精巣内の色素蓄積を促進しないので、 白の背景に、典型的には、ほとんどのトランスジェニック株は、、また白い精?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、リー·ラボでカレンヘイルズから専門家の助言で精子形成を研究するため、これらの受け入れ方法を確立するために、マイケル·アンダーソンに感謝したいと思います。 H·小田とY秋山-ODAは、寛大に、γ-チューブリン-GFPは株式を飛ぶ提供。この作品は、LAL（GM074044）にNIHのR01の助成金によってサポートされていました。
Materials
| Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish |
| PAP pen | Fisher Scientific | NC9888126 | Ted Pella #22309 |
| Clear nail protector | Wet n Wild | 7780235001 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T6557 | |
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-165-003 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC61511-0040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| 16% Formaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D-9542 | 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20°C |
| NaCl | Research Products International Corp. | S23020 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Kimwipes delicate task wipers | Fisher Scientific | S47299 | |
| BSA | Research Products International Corp. | A30075 | Molecular biology grade |
| Glass Coplin staining jar, screw cap | Electron Microscopy Sciences | 70315 | |
| Single frosted microscope slides | Corning | 2948-75X25 | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Polysciences, Inc. | 22247-1 | Optional (to replace untreated microscope slides ) |
| Square cover glass | Corning | 2865-22 | |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Kimax Petri dish | Fisher Scientific | S31473 | Kimble #23060 10015 EMD |
| Forceps | Dumont | 52100-51S | Pattern 5 INOX |
| Name of Equipment | Company | ||
| Stemi 2000-CS stereoscope | Carl Zeiss | ||
| Eclipse 80i | Nikon | ||
| Plan-Fluor 40x objective | Nikon | ||
| Axiophot | Carl Zeiss | ||
| Plan-Neofluar Ph2 40x objective | Carl Zeiss |
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