Fácil Medición de Difusión Coeficientes de etiquetado-EGFP Plasma Proteínas de la Membrana Usando k-espacio Correlación Imagen Spectroscopy

Summary

Este documento proporciona una guía paso a paso a la técnica de análisis de fluctuación de imagen k-espacio espectroscopia de correlación (CCI) para la medición de los coeficientes de difusión de la etiqueta fluorescente proteínas de la membrana plasmática en células de mamíferos vivos.

Abstract

Difusión lateral y la compartimentación de proteínas de la membrana de plasma están fuertemente regulados en las células y, por tanto, el estudio de estos procesos se revelan nuevas perspectivas al plasma la función de proteínas de membrana y la regulación. Recientemente, k-espacio de correlación de imágenes de espectroscopia (CCI) ¹ fue desarrollado para permitir mediciones de rutina de los coeficientes de difusión directa a partir de imágenes de proteínas de la membrana plasmática marcados con fluorescencia, que evitaron sesgos sistemáticos introducidos por fotofísica sonda. Aunque la base teórica para el análisis es complejo, el método puede ser implementado por los no expertos utilizando un código libremente disponibles para medir los coeficientes de difusión de las proteínas. CCI calcula una función de correlación de tiempo a partir de una imagen Pila microscopía de fluorescencia después de la transformación de Fourier de cada imagen para recíproca (k-) el espacio. Posteriormente, promediado circular, logaritmo natural transformada lineal y se ajusta a la función de correlación se obtiene el coeficiente de difusión. Estedocumento proporciona una guía paso a paso para el análisis de imágenes y la medición de los coeficientes de difusión a través de las CCI.

En primer lugar, una secuencia de imágenes de alta velocidad de fotogramas de una proteína de membrana plasmática marcada con fluorescencia se adquiere mediante un microscopio de fluorescencia. Entonces, se selecciona una región de interés (ROI) evitando orgánulos intracelulares, vesículas en movimiento o que sobresale regiones de membrana. La pila de retorno de la inversión se importa en un código de libre acceso y varios parámetros definidos (véase la sección Método) se establecen para el análisis de las CCI. Entonces, el programa genera una "pendiente de las laderas" complot de las funciones de correlación de tiempo k-espacio, y el coeficiente de difusión se calcula a partir de la pendiente de la parcela. A continuación se muestra un procedimiento paso a paso las CCI para medir el coeficiente de difusión de una proteína de membrana utilizando el renal canal de agua acuaporina-3 etiquetados con EGFP como un ejemplo canónico.

Introduction

La organización espacio-temporal de cuatro dimensiones y la movilidad lateral de proteínas de membrana de plasma están fuertemente regulados y pueden desempeñar un papel en la función de la proteína, la actividad y de las interacciones proteína-proteína. Difusión lateral de las proteínas de la membrana plasmática, que tradicionalmente se ha estudiado mediante el cálculo de los coeficientes de difusión de las partículas individuales de time-lapse de punto cuántico o teñir las proteínas de membrana plasmática etiquetados ^2-4. Este enfoque requiere la inserción de una etiqueta extracelular en la proteína de la membrana de plasma de punto cuántico o tinte de etiquetado, lo que puede comprometer plegado y función de las proteínas y, por tanto, no pueden ser alcanzados para algunas proteínas. El volumen estérico de un punto cuántico se ha demostrado que reducir la velocidad de difusión de la proteína ⁵ y por otra parte, sólo una pequeña fracción de las proteínas de la población está marcada con puntos cuánticos, y no se sabe si esta fracción es representativa para el total grupo de proteínas de la membrana de plasma. Tra de partículas individualescking (SPT) mediciones de los coeficientes de difusión de imagen de serie de proteínas marcadas puntos cuánticos implica el mapeo de las posiciones de los picos fotografiados de las partículas con dos gaussiana bidimensional encaja seguido de algoritmos de análisis extensos. El análisis es computacionalmente muy intensivo, que requiere extensa de curva no lineal apropiado en cada cuadro de imagen de una secuencia de lapso de tiempo a las aproximaciones de la función de dispersión de punto microscopio (típicamente de dos dimensiones gaussianas espacial) y la posterior unión de las posiciones de partículas en trayectorias de las partículas que describe el movimiento de las moléculas individuales ^6,7.

Una técnica de correlación de imágenes recientemente desarrollada, k-espacio Correlación Imagen Espectroscopía (CCI) permite mediciones sencillas relativas de los coeficientes de difusión de los etiquetados con fluorescencia proteínas de la membrana de plasma. La posibilidad de calcular de forma rutinaria coeficientes de difusión de las proteínas de membrana marcadas con proteínas fluorescentes por las CCI es una herramienta única que mantienevarias ventajas sobre cuántica tradicional salpican análisis SPT: No se requiere la inserción de etiquetas y tiempo extracelulares que consumen etiquetado extracelular (líneas celulares que expresan proteínas fluorescentes se pueden utilizar); los coeficientes de difusión se extraen de la piscina total de proteínas fluorescentes en comparación con un subconjunto marcado con puntos cuánticos; análisis es simple sin la necesidad de realizar un seguimiento de las proteínas individuales y el análisis se puede realizar utilizando un código existente con ningún requisito para la programación de usuario adicional. El método es rápido, ya que es una técnica de promedio que permite el cálculo rápido y cálculo de los coeficientes de difusión. Estas mediciones de difusión rápida para la población de proteínas se complementan la información de transporte molecular más detallada obtenida de un subconjunto de la población por los métodos SPT esmerados.

tiempo CCI correlaciona secuencias de imágenes de microscopía de fluorescencia que primero han sido transformadas para el espacio de Fourier, y por lo tanto separa flfluctuaciones uorescencia debido a fotofísica de las debidas al transporte molecular ^1. Como resultado, las CCI pueden determinar la densidad del número, la velocidad de flujo, y la difusión de moléculas, mientras que la etiqueta fluorescente ser imparcial por fotoblanqueo complejo o parpadeo de los fluoróforos. Esto hace que las CCI una herramienta útil para determinar rápidamente la dinámica de difusión de proteínas de membrana de células con fluorescencia marcado con y sin la necesidad de algoritmos de escritura personalizados. Además de las proteínas marcadas fluorescentemente, CCI también se pueden aplicar a proteínas de membrana de punto marcado cuánticos ^8.

Este documento ofrece una introducción paso a paso de cómo utilizar las CCI para extraer los coeficientes de difusión de las proteínas de la membrana plasmática de etiquetado EGFP mediante la demostración de cómo colocar la cosecha, cómo utilizar el código y cómo evaluar las parcelas generadas, de las cuales la difusión coeficientes se extraen. A modo de ejemplo, los datos obtenidos por hilado conjunto de discos-microscopía en semi-reflexión interna total fluorescenciaModo nce (TIRF), de un canal de agua renal de proteínas acuaporina-3 (AQP3) etiquetados con EGFP se presenta.

Protocol

Adquisición de proteínas EGFP-etiquetados en la membrana de plasma para el análisis de CCI se puede hacer en un microscopio de epifluorescencia, una configuración de TIRF o en un microscopio de disco giratorio fijado para adquirir imágenes de la membrana de interés. El tamaño de los píxeles de la cámara, así como el tiempo entre cuadros de imagen es necesaria para el análisis. Las secuencias de imágenes de 100-1,200 fotogramas a una velocidad de 4-30 Hz se pueden utilizar para el análisis. Durante la adquis…

Representative Results

Para adquirir pilas de imágenes adecuadas para ser analizadas con las CCI, se pueden utilizar diferentes sistemas de microscopio. Es posible analizar secuencias de imágenes de un microscopio de epi-fluorescencia, así como una configuración de disco TIRF o girando. La membrana debe ser plana sin grandes orgánulos celulares móviles o en movimiento vesículas / objetos. En este trabajo se presenta una secuencia de imágenes de lapso de tiempo de AQP3 etiquetados con EGFP en células MDCK en vivo fotografiados en un m…

Discussion

En este trabajo se presenta una descripción detallada paso a paso de cómo aplicar el método de análisis de las CCI para determinar los coeficientes de difusión de imágenes de microscopía de proteínas marcadas con proteínas fluorescentes. El análisis es independiente de la elección de la sonda con un muy amplio rango dinámico en la densidad de etiquetado y puede por lo tanto también se puede aplicar a proteínas marcadas con puntos cuánticos, así como colorantes y proteínas fluorescentes tales como EGFP. …

Materials

DMEM	Gibco	31600-083
FBS	Invitrogen	10082147
Penicilin	Sigma	13752
Kanamycin	Gibco	15160070
Streptomycin	Gibco	11860038
Phenol red free medium	Gibco	11880-028
DMSO	Sigma	D8418
HEPES	Gibco	15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope	Nikon	Ti Eclipse
EMCCD Camera	Andor	Ixon+