k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定
Summary
本論文では、生きた哺乳動物細胞内で蛍光標識した細胞膜タンパク質の拡散係数を測定するための変動解析手法のk空間画像相関分光法（KICS）のステップバイステップガイドを提供しています。
Abstract
横方向の拡散および原形質膜タンパク質の区画化は、細胞内で緊密に調節され、従って、これらのプロセスを研究することは、原形質膜タンパク質の機能および調節への新しい洞察を明らかにする。最近ではk空間イメージ相関分光法（KICS）1は、プローブ光物理学によって導入系統的な偏りを回避し、蛍光タグ付き原形質膜タンパク質の画像から直接拡散係数のルーチン測定を可能にするために開発された。分析のための理論的基礎は複雑であるが、この方法は、タンパク質の拡散係数を測定するために自由に利用可能なコードを用いてnonexpertsによって実現することができる。 KICSは逆数（のk）空間に、各画像をフーリエ変換した後に蛍光顕微鏡画像スタックから時間相関関数を計算する。続いて、平均円形、自然対数変換及び線形相関関数にフィットする拡散係数が得られる。この論文は、KICS介して画像解析し、拡散係数の測定にステップバイステップのガイドを提供しています。
まず、蛍光標識された原形質膜タンパク質の高フレームレート画像シーケンスは、蛍光顕微鏡を用いて取得される。次いで、関心領域（ROI）、細胞内小器官を避け小胞の移動やメンブレン領域の突出が選択される。 ROIのスタックは、自由に利用可能なコードにインポートされ、いくつかの定義されたパラメータ（方法の項を参照）がKICS解析のために設定されている。次に、プログラムは、k空間時間相関関数からのプロット "斜面の傾き」を生成し、拡散係数はプロットの勾配から計算される。以下腎水路アクアポリン3標準的な例として、EGFPでタグを用いて、膜タンパク質の拡散係数を測定するためのステップバイステップKICS手順である。
Introduction
原形質膜タンパク質の4次元空間時間的組織及び横移動度が厳密に調節され、タンパク質の機能、活性およびタンパク質 – タンパク質相互作用において役割を果たし得る。原形質膜タンパク質の側方拡散は、伝統的に、量子ドットのタイムラプス撮影から単一の粒子のための拡散係数を計算するか、標識された細胞膜タンパク質2-4を染色することによって研究されている。このアプローチは、タンパク質の折り畳みおよび機能が損なわれる可能性があり、したがって、いくつかのタンパク質のために達成することができない量子ドットまたは染料標識のための原形質膜タンパク質、細胞外のタグの挿入を必要とする。量子ドットの立体容積が5タンパク質の拡散を遅くすることが示されており、また、集団内のタンパク質の小さな部分だけが量子ドットで標識され、そしてこの画分は合計で表す場合、それは知られていない原形質膜タンパク質のプール。単一粒子TRAcking量子ドット標識されたタンパク質の画像シリーズからの拡散係数の（SPT）の測定は、大規模な解析アルゴリズムに続く2次元ガウスフィットの粒子の画像化されたピーク位置をマッピングが含まれます。分析は、顕微鏡点広がり関数（典型的には2次元空間ガウシアン）と記述する粒子軌道にパーティクル位置のその後の架橋の近似値に経時系列の画像フレームごとに大規模な非線形曲線フィッティングを必要とする、計算上非常に集約的である単一分子6,7の動き。
最近開発された画像相関法はk空間イメージ相関分光法（KICS）は、蛍光原形質膜タンパク質をタグ化拡散係数の相対的な単純な測定を可能にする。日常的にKICSによって蛍光タンパク質で標識された膜タンパク質の拡散係数を計算する可能性が成立するユニークなツールである従来の量子井戸に比べていくつかの利点がSPT分析ドット：細胞外標識を消費し、細胞外のタグと時間の無挿入が必要とされない（蛍光タンパク質を発現する細胞株が使用されてもよい）;拡散係数は、量子ドットで標識されたサブセットと比較して、蛍光タンパク質のプール全体から抽出され;分析は、単一のタンパク質を追跡する必要なく、簡単であり、分析は、追加のユーザプログラミングのための要件なしで既存のコードを使用して行うことができる。これは拡散係数の高速計算及び計算を可能に平均化技術であるため、この方法は迅速である。タンパク質の人口のためにこれらの急速な普及の測定は、骨の折れるSPT法による人口のサブセットに対して得、より詳細な分子の輸送情報を補完します。
KICS時間は、第1のフーリエ空間に変換されている蛍光顕微鏡画像シーケンスを相関し、それによってオンスを分離する分子輸送1によるものと光物理のためuorescence変動。その結果、KICSは数密度、流速、および複雑な光退色によって、公正なあるかまたはフルオロフォアの点滅しながら、蛍光標識された分子の拡散を決定することができる。これは、KICSすばやくカスタム書き込みアルゴリズムの必要なしに蛍光標識された細胞膜タンパク質の拡散動力学を決定するための有用なツールとなる。他に蛍光標識されたタンパク質は、KICSはまた、量子ドットで標識された膜タンパク質8に適用することができる。
本稿では、コードとどのように生成されたプロットを、評価するための使用方法を、作物を配置する方法を示すことにより、EGFPタグ化細胞膜タンパク質の拡散係数を抽出するためにKICSを使用する方法のステップバイステップの概要を説明した拡散から係数が抽出される。一例として、半全反射顕微鏡において、ディスクセットを紡糸して得られたデータは、蛍光を発するEGFPでタグ付けされた腎臓の水チャネルタンパク質アクアポリン3（AQP3）のNCE（TIRF）モードでは、提示されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、蛍光タンパク質で標識されたタンパク質の顕微鏡画像から拡散係数を決定するために、KICS解析法を適用する方法の詳細なステップバイステップの概要を発表した。分析は、標識密度の非常に広いダイナミックレンジを有するプローブの選択とは無関係であり、従って、量子ドットならびにEGFPのような色素および蛍光タンパク質で標識されたタンパク質に適用することができる?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、LNNにルンドベックジュニアグループリーダーフェローシップによってサポートされていました。 PWWは自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）からの助成金のサポートを認めるものです。また、ディスク顕微鏡を回転へのアクセスのために、南デンマーク大学のデンマークの分子バイオイメージングセンターに感謝します。
Materials
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