Первичная культура человека вестибулярного шванномы
Summary
Вестибулярная Шванномы (VSS) не являются злокачественные опухоли Шванн клеток (СК) происхождения, связанные с мутациями в гене опухолевого супрессора NF2. Мы сообщаем о воспроизводимой, эффективный протокол для первичных человеческих VS культуре клеток, которая позволяет молекулярной и клеточной экспериментальной манипуляции и анализа и повторяет гетерогенную природу болезни человека.
Abstract
Вестибулярные шванном (VSS) представляют Шванн клетки (СК) опухолей вестибулярного нерва, ущерба 10% всех внутричерепных новообразований. VSs произойти в любом спорадических или семейных (нейрофиброматоз типа 2, NF2) формах, как связанных с инактивирующих дефектов в супрессоров опухолей NF2 ген. Лечение VSS, как правило, хирургическая резекция или радиохирургия, однако заболеваемость таких процедур привела расследования менее инвазивных процедур. Исторически сложилось так, отсутствие доступа к образцов свежих тканей и тем, что шваннома клетки не увековечена значительно затрудняло использование первичных культур для исследования шваннома опухолей. Чтобы преодолеть ограниченный запас первичных культурах, увековечены клеточная линия HEI193 В.С. был сгенерирован трансдукции ВПЧ Е6 и Е7 онкогенов. Это онкогенного трансдукции внесены существенные молекулярные и фенотипические изменения в клетках, которые ограничивают их использование в качестве модели для человека сchwannoma опухоли. Поэтому мы иллюстрируют упрощенную, воспроизводимое протокол для культуры первичных человеческих VS клеток. Это легко освоен метод позволяет для молекулярных и клеточных исследований, которые более точно воспроизводят сложность заболевания VS.
Introduction
Вестибулярные шванном (VSS) представляют Шванн клетки (СК) опухолей вестибулярного нерва, ущерба 10% всех внутричерепных новообразований 1-3. VSs произойти в любом спорадических или семейных (нейрофиброматоз типа 2, NF2) формах, как связанных с инактивирующих дефектов в супрессоров опухолей NF2 ген. Лечение VSS, как правило, хирургическая резекция или радиохирургия, однако заболеваемость таких процедур включает глухота, лица невропатии, утечка спинномозговой жидкости, дисбаланс и опухоли отрастания 1. Кроме того не все пациенты являются приемлемыми хирургические или радиационные кандидатов. Столь значительный заболеваемости, а также отсутствие альтернативных методов лечения загнал расследование уникальной молекулярной биологии VSS в надежде разработке новых методов лечения 3,4.
Клеточные культуры позволяет быстро, легкому, и углубленного анализа молекулярной и клеточной поведения и скрининга потенциального терапевтического комфунтов. Исторически сложилось так, отсутствие доступа к образцов свежих тканей и тем, что шваннома клетки не увековечена значительно затрудняло использование первичных культур для исследования шваннома опухолей. Чтобы преодолеть ограниченный запас первичных культурах, увековечены клеточная линия HEI193 В.С. был сгенерирован трансдукции ВПЧ Е6 и Е7 онкогенов 5. Это онкогенного трансдукции внесены существенные молекулярные и фенотипические изменения в клетках, которые ограничивают их использование в качестве модели для опухолей шваннома человека. SC культуры, полученные из трансгенных линий мышей, которые не имеют функциональный ген NF2 представляют другую альтернативу для расследования УХЛ2-зависимую SC туморогенез в пробирке. Эти культуры, однако не в состоянии повторять гетерогенную природу человека VSS или счета для конкретного поведения человека. Большинство предыдущих методы VS культуры требуется относительно длинные сроки обработки и сложных методов селективного культуры 6-8.Здесь мы представляем простой, воспроизводимый протокол для первичной VS культуре клеток с полной переработки в рамках 3 часов, с 95%-ной чистоты опухолевых клеток, как определяется иммунной окраски.
Protocol
Representative Results
Discussion
История в пробирке шваннома культур
Усилия по созданию в пробирке культур шваннома начал всего несколько десятилетий после первоначального невриномы слухового нерва открытая хирургическая резекция произошло в 1894 12. Первые записанные культур?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержка: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100mm Round Culture Dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4 well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8 well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction Filter Flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small Scissor | FST | 14058-11 | |
| Small Forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel Handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel Blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological Pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated Ice Cooler | |||
| Culture Hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine Insulin (1mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T. Neurofibromatosis type 2. Adv Otorhinolaryngol. 70, 91-98 (2001).
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al. Experimental neurinoma in tissue culture. Acta Neuropathol. 21 (2), 154-164 (1972).
- Kaasinen, S., et al. Culturing of acoustic neuroma–methodological aspects. Acta Otolaryngol Suppl. 520 Pt 1, 25-26 (1995).
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd, , et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
