Eine Alkali-brennen Verletzungsmodell der Hornhaut Neovaskularisation bei der Maus
Summary
Neovaskularisation (NV) der Hornhaut können mehrere optische Pathologien erschweren. Mit Hilfe eines kontrollierten, alkali Verbrennungen Modell kann ein quantifizierbarer Höhe der Hornhaut NV für mechanistische Studie der Hornhaut NV und Bewertung von möglichen Therapien für neovaskulären Erkrankungen hergestellt werden.
Abstract
Unter normalen Bedingungen ist die Hornhaut avaskulären, und diese Transparenz ist wichtig für die Erhaltung der Sehschärfe. Neovaskularisation (NV) der Hornhaut, die durch Trauma, Keratoplastik oder ansteckende Krankheit verursacht werden kann, bricht die so genannte "angiogenen Privileg" der Hornhaut und bildet die Grundlage für mehrere visuelle Pathologien, die bis zur Erblindung führen kann. Obwohl es mehrere Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung, bleibt das grundlegende medizinische Notwendigkeit durch Hornhaut neovaskulären Erkrankungen vorgestellt ungedeckten. Um eine sichere, effektive und zielgerichtete Therapien zu entwickeln, ist ein zuverlässiges Modell der Hornhaut NV und pharmakologische Intervention erforderlich. Hier beschreiben wir ein alkali Verbrennungen corneale Neovaskularisierung Modell in der Maus. Dieses Protokoll liefert ein Verfahren für die Anwendung eines kontrollierten alkali Verbrennungen der Hornhaut, die Verabreichung einer pharmakologischen Verbindung von Interesse, und die Visualisierung des Ergebnisses. Diese Methode könnte sich als Instrumentalisierungtal für die Untersuchung der Mechanismen und Interventionsmöglichkeiten in der Hornhaut NV und anderen neovaskulären Erkrankungen.
Introduction
Hornhautblindheit ist die vierthäufigste Ursache für Erblindung, für ca. 4% aller Fälle 1 verantwortlich. Hornhaut-Neovaskularisation (NV) spielt eine bedeutende Rolle in vielen dieser Erkrankungen, einschließlich Herpes-Keratitis (der führende infektiöse Ursache für Erblindung im Westen) und Trachom (die häufigste Ursache für Blindheit weltweit Infektions) 2. Aktuelle Therapien umfassen Steroide, nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs), Anti-VEGF-Therapien und Cyclosporin A als auch konventionelle oder Laseroperationstechniken 3. , Die stark schwächende Natur der Hornhaut NV basierend Pathologien, der Mangel an chirurgischen Einrichtungen in der Lage, die Behandlung von Hornhaut NV, und das Fehlen einer dringend, pharmakologische Option führte jedoch eine aktuelle Expertenrunde zu dem Schluss, dass trotz der vorhandenen Therapien, die grundlegende medizinische Bedarf von diesen Pathologien vorgestellt bleibt unerfüllte 4.
Der menschlichen Hornhautbesteht aus 5 Schichten, drei Zellschichten (Epithel-, Stroma und Endothel) und 2-Schnittstelle (Bowman-Membran und Descemet-Membran). Es fungiert als mechanische Barriere und Brechungsfläche für das Auge. Sein transparentes Natur ist die Folge einer empfindlichen Balance ihrer Bestandteile und ist integraler Bestandteil seiner richtigen Funktion 5. Normalerweise avaskuläre, erhält der Hornhaut Blut von Mikrogefäßen entlang der Außenkante, die aus der Augenheilkunde und ciliary Arterien gespeist ausgeführt werden. Hornhaut NV tritt auf, wenn ein Stimulus Angiogenese fördert dieser Behälter so dass sie in Richtung der Mitte der Hornhaut zu wachsen und somit Vision 6 begrenzen. Hornhaut-Angiogenese und Lymphangiogenese hemangiogenesis enthält, die in das Einwachsen von Blutgefäßen und Lymphgefäßen aus dem Limbus Gefäßarkade in Richtung der Mitte der Hornhaut führen. Dies führt zu einem Zusammenbruch der Hornhaut "angiogenen Privileg", eine Erhöhung der Hornhauttrübung und Fibrose, Störung der Hornhaut laAnwälten, 7 und Ödeme. Die genauen Auslöser von Hornhaut NV zahlreich sind, die von einer Reaktion auf Infektionskrankheiten, wie Bindehautentzündung zu einer chemisch induzierten Zustand verursacht traditionellen Arzneimitteln, Industriechemikalien, oder auch chemische Kampfstoffe.
Die molekularen Mechanismen, die an diesem Verfahren sind nicht, wie noch vollständig charakterisiert; aber ein paar wichtige Spieler sind identifiziert worden. Unter normalen Bedingungen ist die Hornhaut besitzt eine einzigartige "angiogenen Privileg durch eine redundante Anordnung von anti-angiogenen Faktoren (wie lösliche VEGF-R1) 8 gehalten. Als Reaktion auf einen externen Stimulus (z. B. einer Verletzung), es wird eine lokale Hochregulation von pro-angiogenen Faktoren (z. B. VEGF-A). Diese Tipps das Gleichgewicht der pro-und anti-angiogenen Faktoren, die angiogene Privileg der Hornhaut zu Grunde liegt, und führt zu hemangiogenesis, lymphangeogenesis und Entzündung, daher verursacht Hornhautpathologie und sogar Blindheit 9.
<p class = "jove_content"> Angesichts der nicht gedeckten medizinischen Bedarf dieser stark beeinträchtigende Krankheit, von Interesse für den Bereich ist es, eine zuverlässige Tiermodell der Hornhaut NV haben. Hier präsentieren wir ein solches Modell: kontrollierte alkaliBrandVerletzungen. Verschiedene Augenverletzung Modelle, die auf Verwendung von Filterpapier Ringe sind seit 1970 10 verwendet worden. 1989, dadurch gekennzeichnet, eine Gruppe der Harvard Medical School Ophthalmologen ein Standardmodell eines zentralen Hornhautalkalibrandverletzung bei Kaninchen anhand von Einweichen ein Stück Papierrundfilter mit Natriumhydroxid (NaOH) und es auf die Hornhaut in einem bestimmten Bereich von Konzentrationen 11. Seitdem hat sich diese Technik für die Verwendung in der Maus 12-14 angepasst. Vor kurzem untersuchte das Labor Wang die therapeutische Wirkung des Histon-Deacetylase (HDAC)-Inhibitor SAHA in der Pathogenese der Hornhaut NV mit einer Maus Hornhautalkali Verbrennungen Modell 15. Die Methodik der Maus Hornhautalkali Verbrennungen hier vorgestellten Modell gebaut wurdevor allem auf die Arbeit von zwei anderen Papieren 14,16.Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Protokoll ergibt reproduzierbare Ebenen der hemangiogenesis, Lymphangiogenese und Entzündungen, so dass es ein ideales System, um diese drei (miteinander) Prozesse zu studieren. Während diese Methode produziert zentralen Hornhaut NV, mehrere Methoden, die entwickelt wurden, um mehr gerichtet NV, nämlich das Nähen der Hornhaut verursachen und 17 Wachstumsfaktor-exprimierenden Pellets 18 implantiert, könnten ebenfalls von Interesse sein. Unser Protokoll ist für den Einsatz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für Dr. Xinyu Li Hilfe bei der Erstellung des Manuskripts. SW wurde von einem Startup-Fonds von der Tulane University, Präsident des Forschungsrates New Investigator Award vom UT Southwestern Medical Center, NIH EY021862, einer Karriereentwicklung Auszeichnung von der Forschung zur Blindheit Fundament verhindern, und eine helle Focus Award in altersbedingte Makuladegeneration Forschung unterstützt .
Materials
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 18 Guage Needle | BD | 305918 | |
| 10 mL Syringe | BD | 306575 | |
| 25 Guage Needle | BD | 305916 | |
| Anti-F4/80 (rat anti-mouse) | AbD Serotech | MCA497RT | |
| Anti-LYVE-1 (rabbit anti-mouse) | Abcam | ab14917 | |
| Anti-PECAM-1 (rat anti-mouse) | BD | 553370 | |
| Anti-IgG Alexa488 (goat anti-rat) | Invitrogen | A11006 | |
| Anti-IgG Alexa594 (goat anti-rabbit) | Invitrogen | A11012 | |
| Camera | Tucsen | TCC 5.0 ICE | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DMSO | Sigma | D4540-1L | Caution: Mutagenic, Toxic |
| Forceps (Blunt), Iris | WPI | 15915 | |
| Forceps (Sharp), Dumont #4 | WPI | 500340 | |
| KCl | Fisher | P217-500 | |
| Ketamine Solution | MedVet | RXKETAMINE | Controlled substance, proper license required for use. |
| Light Source for Microscope | AmScope | LED-14M-YA | |
| Microscope (Stereo 7X-45X) | AmScope | SM-1B | |
| Mounting Medium, Vectashield | Vector | H-1000 | |
| NaCl | Fisher | S271-10 | |
| NaH2PO4 | Fisher | S397-500 | |
| NaOH | Fisher | S318-1 | Caution: Corrosive |
| Paraformaldehyde | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic | |
| Proparacaine Hydrochloride | Sigma | P4554-1G | |
| Scissors (5mm blade), Vanas | WPI | 14003 | |
| Goat Serum | MPBio | 92939249 | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Whatman Grade 1 Filter Paper | Whatman | 1001-6508 | |
| Xylazine Solution | MedVet | RXANASED-20 |
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