我们描述了实时PCR的协议来分析小分子RNA在脑脊液(CSF)。除的RNA提取的协议,该过程可以扩展到从其它体液,细胞培养,或组织标本中提取的RNA。
微RNA(miRNA)构成由指导RISC到目标位于mRNA的位点,因此,通过调节它们的翻译抑制基因调控的一种有效层。改变的miRNA表达已被证明参与所有主要复杂疾病的发展。此外,最近的研究结果表明,miRNA能够被分泌到细胞外环境,并进入血液和其他体液中,他们可以以高稳定性循环。这种循环miRNA的功能在很大程度上仍然是难以捉摸的,但系统的高通量方法,如miRNA表达谱阵列,已经导致miRNA的签名鉴定的几个病理条件下,包括神经退行性疾病和多种类型的癌症。在此背景下,miRNA的表达谱在脑脊液鉴定,据报道在我们最近的研究,使得miRNA的有吸引力的候选生物标志物分析。
使用该协议,我们已经成功地描出的microRNA在各种类型的细胞系和原代细胞,脑脊髓液,血浆和福尔马林固定,石蜡包埋的组织。
小分子RNA属于小型的家庭(21-23核苷酸长)非编码调控基因表达转录后的RNA。微小RNA可分泌在它们似乎是相对稳定的细胞外空间。在确定改变miRNA的表达可以向鉴定生物标志物的一个重要步骤,进行miRNA表达谱和处理大量数据的可吓人。
在这里,我们描述了一种协议,以确定在脑脊液(适用于其他体液)由一个敏感的实时PCR的变化的miRNA表达。我们还描述了使用软件进行数据分析,包括统计分析和结果的图形表示。整个过程是比较容易和简单,并根据样本进行概要分析和实时PCR机器的数量可用,也比较快的数目。实验部分要求精度处理RNA和移液到384孔板,同时采用GENEX数据分析部分要求在信息学和统计学的一些基本知识。
microRNA是小非编码RNA,通过抑制翻译和/或促进mRNA降解2调节基因表达。由于其高稳定性在无细胞的条件下,微小RNA已在许多体液检测。此外,microRNA的独特表达谱已与相关阶段和/或进展中的各种人类癌症3-9。
有可用来分析小分子RNA的几种工具,其中包括经典的芯片阵列或最新的深度测序技术。然而,我们选择利用一个高度敏感的qPCR平台10,11,其具有…
The authors have nothing to disclose.
从心理健康国家研究所:描述该项目由奖号码R01MH079751(F.佩鲁齐PI)的支持。内容完全是作者的责任,并不一定代表心理健康国家研究所和美国国立卫生研究院的官方意见。
Table III. List of equipment
Equipment
Company
Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter
Thermo Scientific
HH05279
Finntip Pipette Tips
9400613
Thermal Cycler C1000
Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes
TLS0801
Flat Cap Strips
TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System
Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil
04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R
Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place
A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge
Fisher
05-090-100
Bench-Top Vortex
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized
02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml
8093
Thermomixer Confort
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15
Sigma
Velp Scientifica
F202A0173
Table IV. List of reagents
Reagents
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns
Exiqon
203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml
203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free
Invitrogen
10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R
203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations
Ambion
AM1556
MS2 RNA carrier
Roche Applied Science
10165948001
2Betamercaptoethanol 98%
Sigma Aldrich
M3148-25ml
Ethanol 100%
Carlo Erba
64-17-5
Nuclease free water
Qiagen
1039480
RNAse Zap®
AM9780