脑脊液的microRNA分析采用实时定量PCR技术

Summary

我们描述了实时PCR的协议来分析小分子RNA在脑脊液（CSF）。除的RNA提取的协议，该过程可以扩展到从其它体液，细胞培养，或组织标本中提取的RNA。

Abstract

微RNA（miRNA）构成由指导RISC到目标位于mRNA的位点，因此，通过调节它们的翻译抑制基因调控的一种有效层。改变的miRNA表达已被证明参与所有主要复杂疾病的发展。此外，最近的研究结果表明，miRNA能够被分泌到细胞外环境，并进入血液和其他体液中，他们可以以高稳定性循环。这种循环miRNA的功能在很大程度上仍然是难以捉摸的，但系统的高通量方法，如miRNA表达谱阵列，已经导致miRNA的签名鉴定的几个病理条件下，包括神经退行性疾病和多种类型的癌症。在此背景下，miRNA的表达谱在脑脊液鉴定，据报道在我们最近的研究，使得miRNA的有吸引力的候选生物标志物分析。

_content“>有可用于分析小分子RNA，如微阵列几个工具，定量实时PCR（定量PCR），以及深度测序。在这里，我们描述一个敏感的方法，通过实时定量PCR技术来分析在脑脊髓液的microRNA。我们用Exiqon的microRNA准备使用的PCR人类面板I和II V2.R，它允许检测742独特的人类微小RNA，我们进行的阵列，一式三份运行，我们使用GENEX专业5软件进行处理和分析数据。

使用该协议，我们已经成功地描出的microRNA在各种类型的细胞系和原代细胞，脑脊髓液，血浆和福尔马林固定，石蜡包埋的组织。

Introduction

小分子RNA属于小型的家庭（21-23核苷酸长）非编码调控基因表达转录后的RNA。微小RNA可分泌在它们似乎是相对稳定的细胞外空间。在确定改变miRNA的表达可以向鉴定生物标志物的一个重要步骤，进行miRNA表达谱和处理大量数据的可吓人。

在这里，我们描述了一种协议，以确定在脑脊液（适用于其他体液）由一个敏感的实时PCR的变化的miRNA表达。我们还描述了使用软件进行数据分析，包括统计分析和结果的图形表示。整个过程是比较容易和简单，并根据样本进行概要分析和实时PCR机器的数量可用，也比较快的数目。实验部分要求精度处理RNA和移液到384孔板，同时采用GENEX数据分析部分要求在信息学和统计学的一些基本知识。

Protocol

以下协议描述了标准程序，从使用现成PCR板CSF和轮廓的microRNA分离RNA。需要注意的是，有机相萃取是可选的，并且该提取的RNA以确保最大的恢复过程中的载体RNA被加入到样品中。因此，没有必要进行量化的RNA。 总体而言，平均为6-8板可以在一天之内运行，如果该cDNA之前（约2小时）的天合成。当所有的样品已经成型并加载到软件进行数据分析。取决于样品/组或它们的组合的用…

Representative Results

从本研究结果先前已公布的1。 图1显示了使用geNorm应用候选参考microRNA的分析结果。因此，2微小RNA中，miR-622和miR-1266，被确定为参考基因和被用于归一化的miRNA值。 对于脑脊液研究中，我们有三组样品的HIV-（N = 10），HIVE（N = 4）和HIV（+）无脑炎（HIV（+）中，n = 5）。这两个群体，HIVE和HIV阳性，与对照病毒组进行了比较。经统计分析?…

Discussion

microRNA是小非编码RNA，通过抑制翻译和/或促进mRNA降解²调节基因表达。由于其高稳定性在无细胞的条件下，微小RNA已在许多体液检测。此外，microRNA的独特表达谱已与相关阶段和/或进展中的各种人类癌症^3-9。

有可用来分析小分子RNA的几种工具，其中包括经典的芯片阵列或最新的深度测序技术。然而，我们选择利用一个高度敏感的qPCR平台^10，11，其具有…

Materials

Table III. List of equipment

Equipment	Company	Catalog Number
Finnpipette Novus Multichannel Pipetter	Thermo Scientific	HH05279
Finntip Pipette Tips	Thermo Scientific	9400613
Thermal Cycler C1000	Biorad
0.2 ml Low Profile, Clear PCR tubes	Biorad	TLS0801
Flat Cap Strips	Biorad	TLS0803
LightCycler® 480 Real-Time PCR System	Roche
LightCycler® 480 Sealing Foil	Roche	04 729 757 001
Refrigerated Centrifuge 5804R	Eppendorf
Swing-bucket Rotor, 4-place	Eppendorf	A-4-44
Bench-Top Mini Centrifuge	Fisher	05-090-100
Bench-Top Vortex	Fisher
1.5 ml Microcentrifuge Tubes, Sterilized	Fisher	02-681-5
Matrix Reagent Reservoir, 25 ml	Thermo Scientific	8093
Thermomixer Confort	Eppendorf
Bench-To Mini Centrifuge Sigma 1-15	Sigma
Bench-Top Vortex	Velp Scientifica	F202A0173

Table IV. List of reagents

Reagents	Company	Catalog Number
Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns	Exiqon	203300
SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml	Exiqon	203400
Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free	Invitrogen	10977-015
MicroRNA Ready to use PCR Human Panels (I+II) V2.R	Exiqon	203608
mirVana™ miRNA isolation Kit, 40 isolations	Ambion	AM1556
MS2 RNA carrier	Roche Applied Science	10165948001
2Betamercaptoethanol 98%	Sigma Aldrich	M3148-25ml
Ethanol 100%	Carlo Erba	64-17-5
Nuclease free water	Qiagen	1039480
RNAse Zap®	Ambion	AM9780