عزل وإعداد جدران الخلايا البكتيرية للتحليل التركيبي بواسطة الترا الأداء الكروماتوغرافيا السائلة
Summary
يتكون جدار الخلية البكتيرية من الببتيدوكليكان، وهي شبكة من الخلايا الجزيئية الكلية من خيوط السكر التي يرتبط بها الببتيدات. الترا الأداء الكروماتوغرافيا السائل يوفر دقة عالية والإنتاجية لاكتشافات جديدة من تكوين peptidoglycan. نقدم إجراء لعزل جدران الخلايا (sacculi) وإعدادها للتحليل لاحقا عبر UPLC.
Abstract
جدار الخلية البكتيرية أمر بالغ الأهمية لتحديد شكل الخلية أثناء النمو والانقسام، ويحافظ على السلامة الميكانيكية للخلايا في مواجهة الضغوط turgor عدة أجواء في الحجم. عبر الأشكال والأحجام المتنوعة للمملكة البكتيرية ، يتكون جدار الخلية من peptidoglycan ، وهي شبكة من فروع السكر الجزيئية المتقاطعة بواسطة الببتيدات القصيرة. تكمن الأهمية المركزية ل Peptidoglycan في علم وظائف الأعضاء البكتيرية وراء استخدامه كهدف للمضادات الحيوية وقد حفزت الدراسات الوراثية والهيكلية والبيولوجية للخلايا حول كيفية تجميعها بقوة أثناء النمو والانقسام. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة إلى تحقيقات واسعة النطاق لتوصيف الأنشطة الأنزيمية الرئيسية بشكل كامل في تخليق peptidoglycan والتركيب الكيميائي لجدران الخلايا البكتيرية. يعتبر التصوير الكروماتوغرافي السائل عالي الأداء (HPLC) طريقة تحليلية قوية لقياس الاختلافات في التركيب الكيميائي لجدران البكتيريا التي تزرع في ظل مجموعة متنوعة من الظروف البيئية والجينية ، ولكن إنتاجيتها غالبا ما تكون محدودة. هنا، نقدم إجراء مباشرا لعزل وإعداد جدران الخلايا البكتيرية للتحليلات البيولوجية peptidoglycan عبر HPLC و Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC)، وهو امتداد ل HPLC يستخدم مضخات لتقديم ضغوط عالية للغاية تصل إلى 15000 رطل في الثانية، مقارنة ب 6000 رطل في PSI ل HPLC. في تركيبة مع إعداد جدران الخلايا البكتيرية المعروضة هنا ، فإن حاقنات العينة منخفضة الحجم ، والكاشفات ذات معدلات أخذ العينات العالية ، وحجم العينة الأصغر ، وأوقات التشغيل الأقصر ل UPLC ستمكن من دقة عالية وإنتاجية لاكتشافات جديدة لتكوين peptidoglycan وبيولوجيا الخلايا البكتيرية الأساسية في معظم المختبرات البيولوجية مع إمكانية الوصول إلى جهاز طرد فائق و UPLC.
Introduction
الهدف من الطريقة الموصوفة هنا هو عزل جدران الخلايا البكتيرية السليمة (sacculi) وهضم peptidoglycan (PG) بحيث يمكن استخدام التصوير اللوني السائل فائق الأداء (UPLC) لتوفير معلومات مثل هوية مكونات الموروببتيد وتركيزاتها ، ومتوسط طول خيوط الجليكان ، وجزء من المواد المشاركة في الروابط المتقاطعة بين الخيوط. لمناقشة مفصلة للكيمياء الحيوية PG والأنواع muropeptide، وهناك العديد من الاستعراضات الممتازة التي تصف بنية PG ودورها في العدوى والمقاومة، مورفوجينيسيس، والنمو1-6. تم تطوير الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) لتحليل PG في البداية من قبل Glauner و Schwarz في الثمانينيات ، وفي الآونة الأخيرة تم تعزيزها وتطبيقها على نطاق واسع في مختبرات ميغيل دي بيدرو وفالدمار فولمر. استخدمت الأساليب السابقة تحليل الأحماض الأمينية أو الكروماتوغرافيا الورقية ، والتقنيات المستهلكة للوقت والمملة التي لا تسفر عن تقييمات دقيقة أو كاملة لمكونات جدار الخلية.
يمكن تنفيذ تحليل UPLC بسهولة في أي مختبر أبحاث أساسي يمكنه الوصول إلى جهاز طرد مركزي فائق و UPLC. إن طريقة UPLC التي نقدمها أدناه تعزل التكشير الكامل ، وبالتالي توفر معلومات كمية شاملة عن جميع الأنواع الكيميائية فيها. هذه الطريقة تسفر عن تحديد كمي دقيق لجميع muropeptides عبر مجموعة من البكتيريا، وكلها في غضون 20 دقيقة تشغيل UPLC. ولا ينطوي تنفيذ هذه الطريقة إلا على المهارات المختبرية الأساسية، دون استثمار مالي كبير في المواد. من أجل تنفيذ الخطوات في هذه الطريقة ، يحتاج الباحثون فقط إلى أن يكونوا ماهرين في الأنابيب ، وإعداد المخازن المؤقتة والإنزيمات ، وضبط درجة الحموضة ، مما يجعلها في متناول مجموعة واسعة من التخصصات العلمية. اختيار الانزيمات المستخدمة في هذا البروتوكول يعتمد على أنواع البكتيريا التي يجري تحليلها. البروتوكول الموصوف هنا مفيد لEscherichia coli، وقد وجد بشكل عام أنه مناسب لعزل الساكولي عن الكائنات الأخرى السلبية للجرام. ينصح بالتشاور مع الأدب عند تطبيق هذه الطريقة على البكتيريا إيجابية الغرام. في هذه الأنواع، كان تنقية sacculus تقليديا أكثر صعوبة. على وجه الخصوص ، قد يكون من الضروري تغيير هذه الطريقة من حيث اختيار الإنزيم وطول أوقات الهضم لاستيعاب الجدران الأكثر سمكا والبوليمرات الملحقة مثل الأحماض التيتشويك من البكتيريا الإيجابية الغرام. الانزيم الأول في هذا البروتوكول يشق الغشاء الخارجي البروتين الدهني (مثل بروتين الدهون براون، أو Lpp) مرفق peptidoglycan، وبالتالي الإفراج عن جميع ما عدا C-محطة دي -(أو ثلاثي) الببتيد من Lpp من جدار الخلية. هذه الخطوة ضرورية عند فحص Enterobacteria ، ولكن العديد من البكتيريا السلبية الغرام الأخرى ليس لها مكافئات Lpp ، وبالتالي يمكن تخطي هذه الخطوة. إنزيم ثان يشق على وجه التحديد بعد مكون حمض الموميكم من peptidoglycan، solubilizing وحدة فرعية disaccharide التي تشكل الأنواع muropeptide. لتوفير تقييم دقيق لبنية PG ، يجب توخي الحذر في هضم الساكولي لمنع انشقاق الممرات أو أي جزء آخر من جذع الببتيد.
على الرغم من أن التركيبات الكيميائية للبيبتيدوغليكان من أكثر من 100 سلالة من ~ 40 نوعا بكتيريا قد تم تحليلها من قبل HPLC ، لم يتم إجراء أي تحليلات باستخدام تقنية UPLC. بالإضافة إلى ذلك ، تميزت الأعمال السابقة peptidoglycan من جزء صغير فقط من المجال البكتيري ، محدودة جزئيا من إنتاجية HPLC. لذلك ، فإن نشر هذه الطريقة على أكبر عدد ممكن من الباحثين ، والتنفيذ على منصات UPLC ، سيكون حاسما لدفع الدراسات الفسيولوجية للكسر الكبير من الأنواع البكتيرية التي لم يتم تصنيف peptidoglycan لها بعد.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوة حاسمة في هذا الإجراء هي الخطوة 3.1 من اليوم الثاني لإعداد العينة. إذا عجلت SDS بين عشية وضحاها، أو إذا تم تخزين العينات في 4٪ SDS لعدة أسابيع في درجة حرارة الغرفة، يجب إعادة الحصول على العينات لمدة ساعة واحدة على الأقل لإعادة إصدار SDS. السبب الشائع لهطول الأمطار SDS هو استخدام وسائل الإعلام م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل مدير المعاهد القومية للصحة جائزة المبتكر الجديد DP2OD006466 (إلى K.C.H.). يشكر المؤلفون راسل موندز على العرض العملي للطريقة وعلى المناقشات العلمية.
Materials
| Pronase E | Amresco | E629 | |
| Mutanolysin from Streptomyces | Sigma-Aldrich | M9901 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 452882 | Sodium borohydride is highly reactive and dangerous to handle |
| Orthophosphoric acid | Sigma-Aldrich | 79607 | Orthophosphoric acid is corrosive and dangerous to handle |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | 31146 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Sodium azide is a poison |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | |
| Millex 0.22 μm syringe filters | Fisher | SLGVR04NL | |
| pH strips (pH range 0-6) | Fisher | M95863 | |
| 50 ml polypropylene Falcon tubes | VWR | 21008-951 | |
| 13 mm x 100 mm glass tubes | Kimble Chase | 60CM13 | |
| 12 mm x 32 mm screw neck glass recovery vial | Waters | 186000327C | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Ambion | AM9820 | SDS powder is hazardous |
| Instrumentation | |||
| Waters Acquity UPLC H-Class system, including: | |||
| Acquity UPLC H-Class Sample Manager FTN | |||
| Acquity UPLC H-Class Quaternary Solvent Manager | |||
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 µm column | |||
| Acquity UPLC PDA Detector | |||
| Waters Fraction Collector III | |||
| Acquity UPLC 30 cm Column Heater/Cooler | |||
References
- den Blaauwen, T., de Pedro, M. A., Nguyen-Disteche, M., Ayala, J. A. Morphogenesis of rod-shaped sacculi. FEMS Microbiol. Rev. 32, 321-344 (2008).
- Holtje, J. V. Growth of the stress-bearing and shape-maintaining murein sacculus of Escherichia coli. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62, 181-203 (1998).
- Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nat. Rev. Microbiol. 10, 123-136 (2011).
- Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiol. Rev. 32, 149-167 (2008).
- Davis, K. M., Weiser, J. N. Modifications to the peptidoglycan backbone help bacteria to establish infection. Infect. Immun. 79, 562-570 (2011).
- Healy, V. L., Lessard, I. A., Roper, D. I., Knox, J. R., Walsh, C. T. Vancomycin resistance in enterococci: reprogramming of the D-ala-D-Ala ligases in bacterial peptidoglycan biosynthesis. Chem. Biol. 7, 109-119 (2000).
- Desmarais, S. M., De Pedro, M. A., Cava, F., Huang, K. C. Peptidoglycan at its peaks: how chromatographic analyses can reveal bacterial cell wall structure and assembly. Mol. Microbiol. 89, 1-13 (2013).
- Glauner, B., Holtje, J., Schwarz, U. The Composition of the murein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 263, 10088-10095 (1988).
- Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 172 (2), 451-464 (1988).
- Joseleau-Petit, D., Liebart, J. C., Ayala, J. A., D’Ari, R. Unstable Escherichia coli L forms revisited: growth requires peptidoglycan synthesis. J. Bacteriol. 189, 6512-6520 (2007).
- Hakenbeck, R., Holtje, J. V., Labischinski, H. . The target of penicillin: the murein sacculus of bacterial cell walls architecture and growth. , (1983).
- Boylen, C. W., Ensign, J. C. Ratio of teichoic acid and peptidoglycan in cell walls of Bacillus subtilis following spire germination and during vegetative growth. J. Bacteriol. 96, 421-427 (1968).
- Sutow, A. B., Welker, N. E. Chemical composition of the cell walls of Bacillus stearothermophilus. J. Bacteriol. 93, 1452-1457 (1967).
- Wang, W. S., Lundgren, D. G. Peptidoglycan of a chemolithotrophic bacterium, Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 95, 1851-1856 (1968).
- de la Rosa, E. J., de Pedro, M. A., Vazquez, D. Penicillin binding proteins: role in initiation of murein synthesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 5632-5635 (1985).
- Kandler, O., Schleifer, K. H., Dandl, R. Differentiation of Streptococcus faecalis Andrewes and Horder and Streptococcus faecium Orla-Jensen based on the amino acid composition of their murein. J. Bacteriol. 96, 1935-1939 (1968).
- Kumar, A., Saini, G., Nair, A., Sharma, R. UPLC: a preeminent technique in pharmaceutical analysis. Acta Poloniae Pharmaceutica. 69, 371-380 (2012).
- Wilson, I. D., et al. High resolution "ultra performance" liquid chromatography coupled to oa-TOF mass spectrometry as a tool for differential metabolic pathway profiling in functional genomic studies. J. Proteome Res. 4, 591-598 (2005).
- Wieser, A., Schneider, L., Jung, J., Schubert, S. MALDI-TOF MS in microbiological diagnostics-identification of microorganisms and beyond (mini review). Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 965-974 (2012).
