Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür
Summary
Adenilat siklaz sinyal duyarlanmasına inhibitör G protein-eşli reseptörler sonuçları Kalıcı aktivasyonu. Temel moleküler yolları belirlemek için, nonbiased yaklaşımlar gereklidir, ancak bu strateji ölçeklenebilir hücre bazlı cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, küçük molekül ve siRNA taranması için olan bir hassaslaşma deneyi tarif eder.
Abstract
Adenilil siklaza (AC) bir sinyal sensitization, madde bağımlılığı, Parkinson hastalığı dahil olmak üzere nöropsikiyatrik ve nörolojik bozukluklar, çeşitli implike edilmiştir. Gαi / o-bağlanmış reseptörlerin aktivasyonu akut AC aktivitesini inhibe eden, AC heterolog duyarlılaşma bu reseptörler sonuçların kalıcı aktivasyonu ve hücre içi cAMP seviyeleri ise. Önceki çalışmalar, AC yanıt bu artış da dahil olmak üzere, dopamin D 2 ve opioid reseptörleri μ Gαi / o-bağlanmış reseptörlerin çeşitli kronik aktivasyon aşağıdaki in vitro ve in vivo olarak görülmektedir olduğunu göstermiştir. AC heterolog hassaslaşması ilk dört yıl önce rapor edilmiş olmasına rağmen, bu olguyu altında yatan mekanizma (lar) büyük ölçüde bilinmemektedir. Mekanistik veri eksikliği muhtemelen nonbiased yaklaşımları belirlemek yardımcı olabilir düşündüren, bu adaptif tepki ile ilgili karmaşıklığı yansıtırAC heterolog sensitizasyon yer moleküler yolları ing. Önceki çalışmalar AC heterolog duyarlılığa düzenleyen bileşenleri örtüşen olarak kinaz ve Gbγ sinyalizasyon karıştırdılar. AC sensitizasyon ile ilişkilendirilmiş benzersiz ve ek örtüşen hedefleri belirlemek, ölçeklenebilir bir cAMP hassaslaşması testin geliştirilmesi ve doğrulama daha fazla verim için gereklidir. Duyarlaşması Önceki yaklaşımlar sürekli hücre kültürü bakım yanı sıra birden fazla yıkama adımları içerir cAMP birikimini ölçmek için karmaşık bir metodoloji içeren genellikle zahmetlidir. Bu nedenle, 384 formatında yüksek verimli tarama (HTS) için kullanılabilir sağlam bir hücre bazlı tahlilin geliştirilmesi gelecekteki çalışmaları kolaylaştıracaktır. İki D 2 dopamin reseptör hücre modelleri (yani. CHO-D 2L ve HEK-AC6 / D 2L) kullanarak, bir beş-s bizim 48-kuyu hassaslaşması deneyi (> 20 adım 4-5 gün) çevirdimTEP, 384 oyuklu formatta geçen gün deneyi. Bu yeni biçim küçük molekül taraması için uygun olduğunu ve bu deney tasarımı da hali hazırda siRNA hedef kütüphane tarama beklentisiyle siRNA ters transfeksiyonu için kullanılabileceğini göstermektedir.
Introduction
Heterolog-ya da süper-hassaslaşma olarak bilinen tepki sinyalizasyon adaptif bir adenilat siklaz (AC) ilk Nobel ödüllü Dr Marshall Nirenberg laboratuarında keşfedildi. Dr Nirenberg kronik δ opioid reseptör aktivasyonu sonra gözlenen yüksek AC yanıt opiat tolerans ve bağımlılık 1 'de yer alan bir mekanizma olduğunu önerdi. Kronik δ opioid reseptör aktivasyonunun yanı sıra, AC sinyalinin bu nöroadaptif yanıt da birçok Gαi / o-bağlı reseptörlerin 2 kalıcı aktivasyonu takiben oluşur. Özellikle, bu reseptörlerin çoğu ağrı, nöropsikiyatrik ve nörolojik bozukluklar ile bağlantılı ve μ / κ opioid, D 04/02 dopamin, 5HT 1A ve M 2/4 muskarinik reseptörleri 2 içerir. Dr Nirenberg bulgularına ek olarak, kanıt büyük bir gövde, hem kronik opioid reseptör aktivasyonuna AC sinyalizasyon duyarlılığa bağlama Varlığından <ein vitro ve in vivo olarak 3-7 m>. AC Duyarlılık da (inceleme için bakınız referans 2) şizofreni ve Parkinson hastalığı dahil olmak üzere, D-2 gibi dopamin reseptörlerinin rol oynadığı hastalıkların çeşitli ile ilişkilendirilmiştir. Sensitizasyon potansiyel önemine rağmen, kesin mekanizma (lar) AC yanıt büyük ölçüde bilinmemektedir artmasına neden kalıcı Gαi / o kenetli reseptör aktivasyonu ile ilişkilidir.
Bu çalışmalar önemli bir nörobiyolojik bir hedef olarak adenilil siklaz hassaslaşması mekanizmaları incelemek için gerekçe sağlar. Aynı şekilde, bireysel ac izoformlarıdır bu adaptif yanıt tutun 8 sinyal AC fizyolojik alaka ve önemi de 2,9,10 kabul edilmelidir. Araştırmamız bağlamında, AC rekombinant izoformlarının heterolog duyarlılık ile ilgili genel özellikleri bu özellikleri paralel desAC endojen izoformlar incelemek için cribed. Özel olarak, önceki araştırma Gαi / o proteinleri ve daha sonra serbest bırakma / yeniden düzenlenmesidir βγ alt birimlerinin aktivasyon her AC izoformlarının reseptör kaynaklı duyarlılık için önemli bir gereklilik olduğunu bulmuştur. Buna ek olarak, pek çok çalışma, protein kinazların ve Gβγ alt birimlerinin gelen sinyalleri sensitizasyon 2,11-13 dahil olduğunu göstermektedir. Bireysel Klimalar aynı zamanda benzersiz ve farklı hassaslaşması desenler 12. gösterilecek. Yakından ilgili AC3 2 duyarlı değildir oysa Örneğin, bunların agonistlere karşı D2 reseptörlerinin kalıcı maruz kalma, Ca2 + / kalmodulin stimülasyonu 14,15 için AC1 ve AC8 duyarlanmasına ile ilişkilidir. AC2, AC4 ve AC7 yakından Ancak, sadece PKC-uyarılmış AC2 aktivite sağlam 7,14,16,17 agonistlerinden için D 2 reseptörleri uzun süreli maruz kaldıktan sonra hassaslaştırılır ilişkilidir. Ayrıca, AC5 ve AC6 heter belirgin derecede göstermektedirologous D2 reseptörlerinin aktivasyonu 14,18-20 takip Gaz ve forskolin ile uyarılmış cAMP birikimi hassasiyeti, ancak Gβγ alt-birimi-AC'de şartlarına göre farklılık göstermedi 21 etkileşimler. AC Hassasiyet çalışmaların çoğu modeli hücre hatları (örneğin HEK293 hücreleri bireysel AC izoformlarını ifade) kullanılmış olmasına rağmen, bu bulgular yerli nöronal hücre modellerinin 4,22 çevirmek görünür. Daha yakın zamanda, AC izoformlarını eksprese eden HEK293 hücrelerinde tespit AC izoform seçici küçük molekül inhibitörlerinin etkileri de in vivo davranış çalışmalar 23 tercüme edilebilir.
Heterolog sensitizasyon için tanımlanmış bir moleküler mekanizmasının olmaması olası adaptif yanıt karmaşıklığını hem de AC 12 izoformları bireyin kendisine özgü düzenleyici özelliklerini yansıtmaktadır. Bu karmaşıklığı çözülüyor daha hantal metodoloji t kullanılmasıyla karmaşıkşapka tarafsız yaklaşımları kullanılarak akademik araştırmacılar sınırlıdır. Ve 48-çukurlu doku kültür biçimi 15 – Örneğin, önceki mekanistik çalışmalar 24 kullanılarak sürekli olarak kültürlenmiş hücre modellerinin kullanımını içeriyordu. Kültürlenmiş hücreler tipik olarak, 48 saat boyunca büyütüldü ve daha sonra hücre yıkama ve inkubasyon bir dizi (Şekil 1) takip agonist ilaç tedavisi (2-18 saat) tabi tutuldu. AC-izoform özel cAMP birikimi protokoller cAMP metodoloji 15,24 bağlayıcı bir zahmetli ve zaman alıcı bir [3H] cAMP kullanılarak birikiminin ölçülmesi ile takip kullanılan sonra idi. Her bir deney için baştan sona süresi genel olarak hücre kaplama veri analizi (Şekil 1) için 4-5 günlük bir toplam gerekmektedir. Yeni teknolojilerin ve otomasyon uygulaması, endüstriyel ve HTS merkezi bir ortamda sensitizasyon çalışmaları için belirgin geliştirmeleri yol açmıştır. Örneğin, kimyasal Ulusal Merkezi ile çalışan bir grupcal Genomics iki günlük bir 1536-çukurlu formatta 25 μ opioid reseptör kaynaklı duyarlılık küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için deney prosedürü HTS bildirdi.
Bu makale en çok akademik araştırma kurumları bulunmaktadır teknolojilerini kullanarak heterolog sensitizasyon çalışmaları için bir HTS test geliştirmek için çabalarımızı açıklanır. Bu strateji, heterolog ya da endojen Tek tek rekombinant adenilat siklaz izoform (CHO-B 2L ya da HEK-AC6 / D 2 L) ile kombinasyon halinde, dopamin D2 reseptörü ifade eden hücre modellerden dondurularak saklanmış hücrelerin kullanımı dahil edilmesi ile gerçekleştirildi. Bizim verimi artırmak için, biz aslında "mix ve okumak" olduğunu 384-kuyu biçiminde bir beş adım, tek bir gün tahlil için 48 iyi hassaslaşması tahlili (4-5 gün içinde yaklaşık> 20 adım) yeniden tasarlanmış. Yeni format cAMP acc ölçmek için piyasada bulunan bir homojen zaman çözüldü floresan (HTRF) deneyi kullanırBir çok modlu bir plaka okuyucusu ile sağlam hücrelerde umulation. Deney, sağlam ve küçük molekül tarama için uygun olan ve etkili bir şekilde heterolog sensitizasyon inhibitörlerinin taranması için uygulanabilir. Buna ek olarak, genel bir yaklaşım, sadece küçük bir değişiklik ile veya hedef genom geniş siRNA bir arşiv taraması için siRNA ters transfeksiyonu bu tahlilin kullanımı sağlar veri sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heterolog sensitizasyon çalışmalarını kolaylaştırmak için bir çaba, biz kapsamlı bizim önceki yöntem bir aerodinamik elde değiştirdiniz "mix ve okumak" yüksek verimli tarama ve eylem inceleme mekanizmasına iyileştirilebilir biçimi. Şu şekildedir protokolüne büyük değişiklikler özetlenebilir: 1) "deneyi hazır" reaktifler olarak dondurularak saklanmış hücrelerin kullanımı, 384-gözlü biçime deneyi 2) minyatürleştirme ve HTRF ölçüm 3) kullanımı cAMP.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar metodolojik eğitim ve tahlil rehberlik için Bay Richard Zink ve Todd Wiernicki kabul etmek istiyorum. Biz de dikkatli okuma ve editoryal önerileriniz için John Paul Spence teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık MH 060.397, Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı, ve Eli Lilly Enstitüsü ve Lilly Araştırma Ödülü Programı (LRAP) ile Şirket tarafından desteklenmiştir.
Materials
| CHO-K1-DRD2L cells | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham’s F12 media | VWR | SH30026fs | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | SH3007003 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Hygromycin | Fisher | 50-230-5556 | |
| Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| 15 cm dishes | BD Falcon | 353025 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Cell dissociation buffer | Life Technologies | 13150016 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC treated 384 well plates | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad Software | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)Quinpirole | Sigma | Q111 | |
| Spiperone | Sigma | S7395 | |
| Clozapine | Sigma | C6305 | |
| Haloperidol | Sigma | H1512 | |
| S-(-)Sulpiride | Sigma | S112 | |
| Lipofectamine2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Trypan blue | Life Technologies | T10282 | |
| Water, DNase, RNase-free | MP Biomedicals | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | custom siRNA | |
| Non-targeting siRNA control | Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
References
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by Galpha(i/o)-coupled receptors. Pharmacol. Ther. 106, 405-421 (2005).
- Christie, M. J. Cellular neuroadaptations to chronic opioids: tolerance, withdrawal and addiction. Br. J. Pharmacol. 154, 384-396 (2008).
- Fan, P., Jiang, Z., Diamond, I., Yao, L. Up-regulation of AGS3 during morphine withdrawal promotes cAMP superactivation via adenylyl cyclase 5 and 7 in rat nucleus accumbens/striatal neurons. Mol. Pharmacol. 76 (3), 526-533 (2009).
- Bohn, L. M., Gainetdinov, R. R., Lin, R. T., Lefkowitz, R. J., Caron, M. G. m-Opioid receptor desensitization by β-arrestin-2 determines morphine tolerance but not dependence. Nature. 408, 720-723 (2000).
- Nestler, E. J. Molecular basis of long-term plasticity underlying addiction. Nat. Rev. 2, 119-128 (2001).
- Avidor-Reiss, T., Nevo, I., Saya, D., Bayewitch, M., Vogel, Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem. 272, 5040-5047 (1997).
- Sadana, R., Dessauer, C. W. Physiological roles for G protein-regulated adenylyl cyclase isoforms: insights from knockout and overexpression studies. Neurosignals. 17, 5-22 (2009).
- Kim, K. S., et al. Adenylyl cyclase type 5 (AC5) is an essential mediator of morphine action. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3908-3913 (2006).
- Watts, V. J. Adenylyl cyclase isoforms as novel therapeutic targets: an exciting example of excitotoxicity neuroprotection. Mol. Interv. 7, 70-73 (2007).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Regulatory properties of adenylate cyclases type 5 and 6: A progress report. Eur. J. Pharmacol. 535, 1-12 (2006).
- Ejendal, K. F. K., Przybyla, J. A., Watts, V. J., Siehler, S., Milligan, G. Chapter 10. Adenylyl cyclase isoform-specific signaling of GPCRs. G Protein-Coupled Receptors: Structure, Signaling, and Physiology. 10, 189-217 (2010).
- Lin, Y., Smrcka, A. V. Understanding molecular recognition by G protein betagamma subunits on the path to pharmacological targeting. Mol. Pharmacol. 80, 551-557 (2011).
- Cumbay, M. G., Watts, V. J. Heterologous sensitization of recombinant adenylate cyclases by activation of D2 dopamine receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 297, 1201-1209 (2001).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of endogenous and recombinant adenylate cyclase by activation of D2 dopamine receptors. Mol. Pharmacol. 50, 966-976 (1996).
- Nevo, I., et al. Regulation of adenylyl cyclase isozymes on acute and chronic activation of inhibitory receptors. Mol. Pharmacol. 54, 419-426 (1998).
- Nevo, I., Avidor-Reiss, T., Levy, R., Bayewitch, M., Vogel, Z. Acute and chronic activation of the m-opioid receptor with the endogenous ligand endomorphin differentially regulates adenylyl cyclase isozymes. Neuropharmacology. 39, 364-371 (2000).
- Beazely, M. A., Watts, V. J. Activation of a novel PKC isoform synergistically enhances D2L dopamine receptor-mediated sensitization of adenylate cyclase type 6. Cell. Signal. 17, 647-653 (2005).
- Vortherms, T. A., Nguyen, C. H., Berlot, C. H., Watts, V. J. Using molecular tools to dissect the role of Gs in sensitization of AC1. Mol. Pharmacol. 66, 1617-1624 (2004).
- Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
- Ejendal, K. F., Dessauer, C. W., Hebert, T. E., Watts, V. J. Dopamine D(2) Receptor-Mediated Heterologous Sensitization of AC5 Requires Signalosome Assembly. J. Signal Transduct. 2012, 210324 (2012).
- Johnston, C. A., Beazely, M. A., Vancura, A. F., Wang, J. K. T., Watts, V. J. Heterologous sensitization of adenylate cyclase is protein kinase A-dependent in Cath.a differentiated (CAD)-D2L cells. J. Neurochem. 82, 1087-1096 (2002).
- Wang, H., et al. Identification of an adenylyl cyclase inhibitor for treating neuropathic and inflammatory pain. Sci. Transl. Med. 3, 65ra3 (2011).
- Nordstedt, C., Fredholm, B. B. A modification of a protein-binding method for rapid quantification of cAMP in cell-culture supernatants and body fluid. Anal. Biochem. 189, 231-234 (1990).
- Xia, M., et al. Inhibition of morphine-induced cAMP overshoot: a cell-based assay model in a high-throughput format. Cell. Mol. Neurobiol. 31, 901-907 (2011).
- Zaman, G. J., de Roos, J. A., Blomenrohr, M., Van Koppen, C. J., Oosterom, J. Cryopreserved cells facilitate cell-based drug discovery. Drug Discov. Today. 12, 521-526 (2007).
- Varga, E. V., et al. Identification of adenylyl cyclase isoenzymes in CHO and B82 cells. Eur. J. Pharmacol. 348, R1-R2 (1998).
- Masri, B., et al. Antagonism of dopamine D2 receptor/beta-arrestin 2 interaction is a common property of clinically effective antipsychotics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 13656-13661 (2008).
- Thaker, N. G., et al. Functional genomic analysis of glioblastoma multiforme through short interfering RNA screening: a paradigm for therapeutic development. Neurosurg. Focus. 28, E4 (2010).
- Echeverri, C. J., Perrimon, N. High-throughput RNAi screening in cultured cells: a user’s guide. Nat. Rev. Geneti. 7, 373-384 (2006).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Ejendal, K. F., et al. Discovery of antagonists of tick dopamine receptors via chemical library screening and comparative pharmacological analyses. Insect Biochem. Mol. Biol. 42, 846-853 (2012).
- Meyer, J. M., et al. A “genome-to-lead” approach for insecticide discovery: pharmacological characterization and screening of Aedes aegypti D(1)-like dopamine receptors. PLoS Negl.Trop. Dis. 6, e1478 (2012).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem. Biol. 17, 646-657 (2010).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem. Biol. 3, 346-351 (2008).
- Jiang, L. I., et al. Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway. J. Biol. Chem. 282, 10576-10584 (2007).
