בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

Summary

mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה משויך הקרום החיצוני מיטוכונדריה. אנו מתארים הליך חלוקה subcellular שמטרתה בידוד של שמרי המיטוכונדריה עם mRNAs הקשורים אליו והריבוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים שגודל בתנאים מגוונים במטרה לחשוף את המנגנונים של לוקליזציה mRNA ותרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

Abstract

רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין וצריך להיות מיובא לתוך אברון. יבוא עלול להתרחש בזמן שהחלבון מסונתז ליד המיטוכונדריה. תמיכה באפשרות זו נגזר ממחקרים שנעשה לאחרונה, שבו mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה הוצגו להיות מקומי כדי קרבת מיטוכונדריה. יחד עם הפגנות קודמות של העמותה 'הריבוזומים עם הקרום החיצוני, תוצאות אלו מצביעות על תהליך תרגום מקומי. תרגום מקומי כזו עשויה לשפר את יעילות יבוא, לספק אתרי רגולציה ייחודיים ולמזער מקרים של ביטוי מחוץ לרחם. מגוון שיטות שימשו כדי לאפיין את הגורמים ומרכיבים אשר מתווכים תרגום מקומי. תקן בין אלה הוא חלוקה subcellular על ידי צנטריפוגה ההפרש. פרוטוקול זה יש את היתרון של בידוד של mRNAs, ריבוזומים וחלבונים בהליך אחד. אלה אז יכולים להיות מאופיינים על ידי מולקולריים ודו שוניםשיטות ochemical. יתר על כן, ניתן ליישם שיטות transcriptomics ופרוטאומיקה לחומר וכתוצאה מכך, ובכך לאפשר לתובנה הגנום כולו. הניצול של שמרי כאורגניזם מודל למחקרים מסוג זה יש את היתרונות של מהירות, עלויות ופשטות. יתר על כן, הכלים הגנטיים המתקדמים וזני מחיקה זמינים להקל על אימות של גורמי מועמד.

Introduction

תאי אוקריוטים מאורגנים בתאים נפרדים, בעלי פונקציות ספציפיות. כדי להשיג את תפקידה, כל תא מכיל מערך ייחודי של חלבונים שחיוניים לפעילותו. מנגנון אפשרי שבאמצעותו חלבונים אלה מתקרבים התא שלהם הוא על ידי ^1,2 תרגום לשפה מקומי. בתהליך זה, החלבון מסונתז ביעד שלה על ידי הריבוזומים וmRNAs שנמצאים שם. בין היתרונות האפשריים של תרגום מקומי גדלו יעילות של מיקוד חלבון, ירידה בצורך במלווי חלבון, ומאפשר למנגנוני רגולציה ספציפי לאתר. כמו כן, mRNAs והריבוזומים מקומיים יכולים להיות מאגר מבודד של מכונות תרגום במקרים של מתח הסלולר, כאשר תרגום כללי הוא עצור.

מיטוכונדריה הפכה בשנים האחרונות מודל מרכזי ללמוד תרגום מקומי. רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין, המתורגם בcytosol,ומיובא לאברון. קווים שונים של ראיות מצביעים על כך שרבים מחלבונים אלו מיוצרים בתהליך תרגום מקומי. בתחילה, לימודים במיקרוסקופ אלקטרונים וחלוקה ביוכימיים זוהו הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה ^3-5. מחקרים אלה שבו ולאחר מכן אומתו in vivo על ידי עבודה על mRNAs הספציפי, שנמצאו להיות מיובאים רק ^ב6,7 אופן cotranslational. מחקרי הגנום של mRNAs שיתוף עם המיטוכונדריה חשפו כי חלק משמעותי של mRNAs הם מקומיים לסביבת מיטוכונדריה ^8-10. חלקם של mRNAs אלה התאפיינו נוספים על ידי in vivo הקרינה שיטות, כגון דגים או mTAG ^9,11. פרשנות ישר קדימה של עמותה זו היא שmRNAs אלה משמש כתבניות לתרגום לשפה מקומית.

המנגנונים שבאמצעותם mRNAs אלה מתקרבים למיטוכונדריה אינם ידועים. תחומים noncoding (רוב significantl3 UTRs 'y) הוצג להיות מעורב בmRNA העמותה למיטוכונדריה ^12. תחומים אלה עשויים לשמש כאתר קישור לחלבוני קושרי RNA אשר מתווכים התחבורה שלהם. מחקרים בשמרים גילו כי חבר של משפחת PUM של חלבונים (Puf3) תומך בעמותת mRNA עם מיטוכונדריה ^8,13. תפקיד מתקבל על הדעת לPuf3, המבוסס על פונקציות של בני משפחה אחרים, הוא לעכב תרגום ואילו את ה-mRNA הוא הדרך ^14. לפיכך, mRNAs עשוי להיות מועבר במעמד nontranslated, על ידי חלבוני RNA מחייבים כי אינטראקציה עם אזורי noncoding. לחלופין, גוף עבודות גדול מצביע על כך שהתחבורה מתרחשת בזמן שהחלבון הוא להיות מסונתזת. בפרט, מעכבי תרגום הוצגו להשפיע mRNAs עמותה ^8,13. יתר על כן, תכונות תורגמו כגון אוגוסט, רצף של המיטוכונדריה מיקוד (MTS) או אזורי ORF הוצגו כדי לסייע בלוקליזציה ^8,11,15. ch חלבון HSP70 משפחתיaperone וקולטן חלבונים על הקרום החיצוני מיטוכונדריה הוצגו גם כדי לתמוך בעמותת ה-mRNA, רומזים עוד כי תכונות מקודדות חלבונים חשובות ללוקליזציה mRNA ^16. זה עולה בקנה אחד עם מודל שבו החלבון המתעוררים-הריבוזום משמש כאלמנט הכרה למיקוד מורכב mRNA-הריבוזום חלבונים למיטוכונדריה ^17.

תרגום מקומי ליד המיטוכונדריה נחקר על ידי שיטות שונות, ובכלל זה במיקרוסקופ אלקטרונים (כדי להמחיש הריבוזומים) ^3, דגים ^9, RNA הירוק (כדי לזהות mRNAs הספציפי) ^11, וחלוקה ביוכימי (כדי לזהות שני RNA וריבוזומים) ^10,18. בעוד השיטות לשעבר לזהות לוקליזציה in vivo ועשויות לאפשר הדמיה של דינמיקת תחבורה, האחרון מאפשר זיהוי של mRNAs שונים בניסוי יחיד. יתר על כן, לתחומים קידוד חלוקה ביוכימי או noncoding לא צריך להיות אלחזרתי אחורנית, ולכן ניתן להעריך התפקידים הספציפיים שלהם. חלוקה ביוכימיים שמשה בהצלחה במשך שנים רבות, לבידוד תרמי של תאים סלולריים שונים. מנהלים ומגבלותיו מבוססים היטב, ואפשר בקלות לשנות את הפרוטוקולים קיימים למטרות שונות. המכשור הדרוש הוא סטנדרטי במעבדות רבות, ולכן הוא בדרך כלל השיטה הראשונה לבחירה ללימוד לוקליזציה תאית. אנו מתארים פרוטוקול שהיה מותאם לבידוד של mRNAs בעוד הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה. פרוטוקול זה הוא אפוא אופטימלי לחקר גורמים המעורבים בתרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

Protocol

1. מיטוכונדריה טיהור לשקול את גלולה של תאים. בערך 0.6 גרם מתקבלים מ100 תאים למ"ל. לגדול 100-150 מיליליטר של תאי שמרים לOD 600 = 1-1.5 ב30 ° C במדיום גידול nonfermentable, כגון מצע גידול מב?…

Representative Results

פרוטוקול זה מאפשר הפרדה של חלק המכיל את המיטוכונדריה מרכיבי cytosolic. הדרך הטובה ביותר לבחון את הצלחתה היא לבצע ניתוח צפוני וניתוח מערבי (איור 1) לדגימות מצעדי הבידוד השונים. שלושה פרמטרים לאיכות הבידוד נגזרים מניתוחים אלו. ראשית, אם RNA או חלבונים בדגימות הם שלמי…

Discussion

התקדמות טכנולוגית בתחום ההדמיה הניבה כלים ברזולוציה גבוהה ללמוד לוקליזציה mRNA. כיום, ניתן למדוד את התנועה של אפילו מולקולת mRNA אחד בזמן בקנה מידה msec ^23-26. עם זאת, גישות ביוכימיות מסורתיות, כפי שתואר לעיל, גם אינפורמטיבי ועדיפים במקרים מסוימים. בידוד ביוכימיים מאפש?…

Materials

Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M TrisHCl pH9.4
30 mM TrisHCl pH7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this  buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/gr
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/mL Heparin
1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate pH5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-mercaptoethanol
Bromophenolblue
4xLSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle