Analyse rapide et exploration de microscopie par fluorescence Images
Summary
Nous décrivons ici un flux de travail pour analyser rapidement et collections d'images de microscopie de fluorescence à l'aide PhenoRipper, une plate-forme d'analyse d'image récemment développé explorer.
Abstract
Malgré les progrès rapides de la microscopie à haut débit, les tests basés sur l'image quantitatives posent encore des défis importants. Bien qu'une variété d'outils spécialisés d'analyse d'images sont disponibles, la plupart des workflows traditionnels à base de d'analyse d'image ont des courbes d'apprentissage (pour un réglage fin des paramètres d'analyse) et conduisent à longs délais d'exécution entre l'imagerie et l'analyse. En particulier, la segmentation de la cellule, le processus d'identification des cellules individuelles dans une image, est un obstacle majeur à cet égard.
Nous présentons ici un suppléant, sans segmentation des cellules workflow basé sur PhenoRipper, une plate-forme logicielle open-source conçu pour l'analyse et l'exploration des images de microscopie rapide. Le pipeline présentée ici est optimisé pour des images de microscopie par immunofluorescence de cultures de cellules et nécessite une intervention minimale de l'utilisateur. En une demi-heure, PhenoRipper peut analyser des données à partir d'une expérience typique de 96 puits et de générer des profils d'image. Les utilisateurs peuventalors explorer visuellement leurs données, effectuer un contrôle de la qualité de leur expérience, assurer une réponse aux perturbations et vérifier la reproductibilité de répétitions. Ceci facilite un cycle de rétroaction rapide entre l'analyse et l'expérience, ce qui est essentiel au cours de l'optimisation du dosage. Ce protocole est utile non seulement comme une première analyse de la transmission du contrôle de qualité, mais également peut être utilisée comme une solution de bout en bout, en particulier pour le criblage. Le flux de travail décrit ici échelles de grands ensembles de données tels que ceux générés par des écrans à haut débit, et a été montré à la catégorie des conditions expérimentales par phénotype précision sur une large gamme de systèmes biologiques. L'interface PhenoBrowser fournit un cadre intuitive pour explorer l'espace phénotypique et d'associer les propriétés d'image pour annotations biologiques. Dans l'ensemble, le protocole décrit ici permettra de réduire les obstacles à l'adoption analyse quantitative des écrans d'image en fonction.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, les progrès rapides de la technologie d'imagerie ont donné de nombreux laboratoires la possibilité d'effectuer la microscopie à haut débit. Le défi est maintenant passé de l'une des images à une analyse. Comment pouvons-nous caractériser, comparer, et d'explorer le torrent de phénotypes subtils complexes générées par un écran d'imagerie à haut débit typique?
Un certain nombre d'images d'analyse et de plateformes informatiques ont donné utilisateurs boîtes à outils sophistiqués 1-3 pour extraire des informations biologiques provenant de grandes collections d'images. Pourtant, de nombreux obstacles restent importants dans l'analyse des données de écrans à base d'images à haut débit. Difficultés à choisir caractérisations appropriées des images et un réglage fin des paramètres algorithmiques (le système d'intérêt) entraînent souvent des délais d'établissement, en particulier pour les utilisateurs sans compétences d'analyse d'image. En particulier, la segmentation cellulaire, le processus d'identification de cellules individuelles dans unn l'image, est un obstacle majeur à cet égard. La segmentation peut être très sensible à des paramètres expérimentaux tels que le type de cellules, la densité cellulaire et des bio-marqueurs, et nécessite souvent l'ajustement répété pour un grand ensemble de données. Pour ces raisons, l'analyse d'image est souvent une étape terminale indépendante réalisée par des spécialistes plutôt que de faire partie intégrante du flux de travail expérimental. Cela empêche le cycle de rétroaction rapide entre l'analyse et l'expérimentation, un élément essentiel du développement de dosage.
Nous décrivons ici un autre flux de travail qui est optimisé pour haut débit de microscopie par fluorescence et évite bon nombre des difficultés mentionnées ci-dessus. À cette fin, nous faisons usage de PhenoRipper 4, une plate-forme logicielle open-source pour l'exploration et l'analyse des images de microscopie rapide. De manière significative, PhenoRipper évite beaucoup de défis liés à la segmentation des cellules en n'essayant pas d'identifier des cellules individuelles. Au lieu de cela, PhenoRipper divise les images en pixelsblocs de taille subcellulaire et caractérise images en termes de blocs qu'ils contiennent. Plus précisément, PhenoRipper profils blocs en termes de base-colocalisation-marqueurs caractéristiques et identifie automatiquement 4 types de blocs les plus représentatifs dans les images d'apprentissage. PhenoRipper attribue alors à chaque bloc de type de bloc représentant le plus similaire, et finalement caractérise des images basées sur les types des blocs qu'elles contiennent.
Comparé à-cellulaires simples approches plus traditionnelles, cette approche nécessite un réglage amende minimale et l'expertise. Ainsi, les utilisateurs ne doivent régler deux paramètres: la taille de bloc et une intensité de seuil (à jeter parties non cellulaires d'une image), qui sont tous deux mis à la rétroaction graphique. Surtout, le flux de travail décrit ici a été démontré à l'échelle 4 facilement à beaucoup de plus grands ensembles de données, où la vitesse et le réglage amende minimale fournit grand temps et des gains de fiabilité. Dans la pratique, nous constatons que cette applicationgardon réduit le temps nécessaire à la fois pour l'installation et l'exécution de plusieurs ordres de grandeur 4.
La sortie principale du PhenoRipper est une représentation visuelle de l'image de similitude, ce qui permet à l'utilisateur d'identifier des groupes de conditions expérimentales qui causent des cellules à afficher des phénotypes similaires. Les groupements PhenoRipper trouve généralement ont "intelligibilité biologique" comparables à ceux générés par d'autres méthodes, à base de cellules fastidieuses 4. Dans la pratique, cela signifie que, souvent, dans une demi-heure de l'exécution d'une expérience typique de 96 puits microscopie de fluorescence, un expérimentateur sans expérience d'analyse d'image avant peut obtenir une lecture fiable de la performance de son expérience. L'expérimentateur peut alors commencer à explorer les relations entre les différentes conditions expérimentales et concernant ces relations à des phénotypes d'image.
Nous démontrons ce flux de travail ici en analysant les effetsdes médicaments dans les classes mécanistiques distinctes sur les cellules HeLa colorées pour les marqueurs d'ADN et du cytosquelette. Images de cellules traitées avec la même classe de médicaments ont été regroupés, et des images de mauvaise qualité (artefacts de coloration, sur des cellules de réflexion et ainsi de suite) sont apparus comme des valeurs aberrantes, ce qui les rend faciles à identifier et potentiellement jeter.
Bien que ce flux de travail est utile pour un grand nombre d'essais basés sur l'image, il ya clairement de nombreuses situations où une approche différente pourrait être plus informatif. Par exemple, la sortie de PhenoRipper est essentiellement une comparaison relative des motifs de fluorescence dans des conditions expérimentales. Si une caractérisation absolue d'une caractéristique spécifique d'une cellule unique est nécessaire à la place (par exemple le nombre de mouchetures dans une cellule), une seule analyse à base de cellules serait nécessaire. Néanmoins, même dans ce type de situation, PhenoRipper est susceptible de détecter des changements dans ces phénotypes unicellulaires et donc être un outil utile pour le dosage optisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le flux de travail décrit ici permet de caractériser rapide et facile et la comparaison des images de microscopie. Nous avons d'abord montré comment ce flux de travail peut aider à l'optimisation de l'expérience, par exemple en effectuant rapidement le contrôle de la qualité sur les images de microscopie. Ensuite, nous avons démontré son potentiel pour l'analyse des données de criblage à haut débit: nous étions en mesure de médicaments du groupe en fonction de leur mécanisme d'action. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Adam Coster et tous les autres membres des laboratoires Altschuler et Wu pour commentaires et discussions utiles. Cette recherche a été soutenue par l'Institut national de la santé accorde R01 GM085442 et CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), et la Fondation Welch I-1619 (SJA) et I-1644 (LFW).
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
References
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