Nanosurgery הלייזר של האקסונים Cerebellar<em> בVivo</em
Summary
שני פוטונים הדמיה, מצמידים את nanodissection לייזר, הם כלים שימושיים ללמוד תהליכים ניווניים ומשובים במערכת העצבים המרכזית עם הרזולוציה subcellular. פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג, תמונה, ולנתח סיבי טיפוס בודדים בקליפת המוח הקטן in vivo.
Abstract
Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.
Introduction
חיתוך רוחב אקסון כתוצאה מפגיעה מכאנית, עלבון רעיל או מחלות ניווניות בדרך כלל על ידי ניוון של החלק הדיסטלי של האקסון שמנותק מהגוף התא 10-13. עם כמה יוצאים מן הכלל 2,7,14,15, אקסונים ניתקו במערכת העצבים המרכזית של בעלי חיים המבוגרים הם בדרך כלל מסוגלים להפעיל תכנית לצמיחה מחודשת 16.
מעט מאוד ידוע על הדינמיקה של אירועים ניוונית ברמה התאית וsubcellular בזמן אמת. הפיתוח של אסטרטגיות חדשות להגבלת נזק עצבי וקידום צמיחה מחודשת עצבית דורש, כצעד ראשון, מבהיר את המנגנון שבאמצעותו תאים עצביים להפליא פצועים להידרדר ולהתחדש. מחקר זה התייחס באופן ישיר ביותר על ידי ניטור הדינמיקה של נוירון בודד in vivo. בעוד טכניקות דימות פלואורסצנטי אחד פוטון מוגבלות על ידי פיזור אינטנסיבי של אור הנראה, שני פוטונים עירור מגיע לשכבות בקליפת המוח עמוקות בliיש עכברים עם רזולוציה 3,4,17 subcellular. ניצול של עכברים הטרנסגניים שבו חלבוני ניאון באים לידי ביטוי באופן סלקטיבי בתת אוכלוסיות של נוירונים 18-20, מיקרוסקופיה TPF יושמה לחקר פלסטיות הסינפטית והתארכות אקסון במהלך פיתוח in vivo 21,22. T הוא היכולת של הנוירונים שנפגעו באופן מיוחד כדי לגדל מחדש לאחר פציעה יכולה להיחקר על ידי צימוד בניטור vivo על ידי הדמיה שני פוטונים עם מודל של פגיעה הממוקד במיוחד להאקסון של עניין. קליטה רב פוטון של פולסים femtosecond נעשתה שימוש כדי לשבש דנדריטים בודדים או אפילו קוצים בודדים 5,23. יתר על כן, הפרדיגמה פגיעה זו מאפשרת חיתוך ענפי אקסון בודדים מבלי להפריע לדנדריט הפנייה 6. בהקשר של לנתח את התכונות המאפשרות אוכלוסייה עצבית ספציפית להתחדש האקסונים שלהם מרגע שנפגעו, סיבי המוח הקטן טיפוס (CFS) הם si מודל שימושיNCE הם שומרים על תכונות פלסטיק מדהימים לאחר פציעה אפילו בבעלי חיים מבוגרים 24,25. לאחרונה, הדמיה לטווח ארוך של CFS הראתה כי אקסונים אלה מסוגלים Regrowing בימים שאחרי axotomy לייזר 6.
פרוטוקול זה מתאר כיצד לתייג נוירונים olivocerebellar והתארכות אקסון באמצעות התחקות אנטרוגרדית. ברגע שתאי העצב של עניין שכותרתו fluorescently, הם יכולים להיות במעקב שוב ושוב בנקודות זמן שרירותיות במשך שבועות או חודשים מתחת לחלון גולגולתי. ההליך לנתח סניפי אקסון בודדים על ידי axotomy לייזר in vivo לאחר מכן ניתן יהיה מאויר.
הטכניקות המוצגות כאן מספקות תובנות חדשות על המנגנון של שיפוץ אקסון in vivo ועשויות לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות להגביל ניוון עצבי ולקדם לצמיחה מחודשת עצב.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מראה כיצד לתייג את הנוירונים של הזית הנחותה עם פלורסנט לצבוע. כתוצאה מכך, השיטה לביצוע חלון גולגולתי בקליפת המוח הקטן מתוארת. טכניקה זו מספקת גישה אופטית לחלק המסוף של נוירונים olivocerebellar, סיבי הטיפוס. למרבה הצער, התוצאה של שני תיוג וניתוח פתיחת גולגולת היא ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Erica Lorenzetti for technical assistance on the injections and Irene Costantini for making figure 1. The research leading to these results has received funding from LASERLABEUROPE (Grant 284464, European Commission’s Seventh Framework Programme). This research project has also been supported by the Italian Ministry for Education, University and Research in the framework of the Flagship Project NANOMAX and by Italian Ministry of Health in the framework of the “Stem Cells Call for Proposals.” This work is part of the research activities of the European Flagship Human Brain Project and has been carried out in the framework of the International Center of Computational Neurophotonics foundation supported by “Ente Cassa di Risparmio di Firenze”.
Materials
| Lab standard stereotaxic, rat and mouse | Stoelting | 51670 | |
| Borosilicate glass with filament | Sutter Instrument Inc | BF100-50-10 | |
| Germinator 500 (Glass bead sterilizer) | Roboz | ||
| Microinjection dispense system | Picospritzer | ||
| Small diameter round cover glass, #1 thickness, 3 mm, 100 pack (CS-3R) | Warner Instruments | 64-0720 | |
| Ti:Sapphire laser, 120 fs width pulses, 90 MHz repetition rate | Coherent | Chameleon | |
| Spongostan, haemostatic sponge | Ferrosan | MS0005 | |
| Galvanometric mirrors | GSI Lumonics | VM500+ | |
| Objective | Olympus | XLUMPLFLN 20XW | |
| Piezoelectric stage | Physik Instrumente | P-721 | |
| Photomultiplier modules | Hamamatsu Photonics | H7710-13 | |
| LabVIEW System Design Software | National Instruments | ||
| Voren, 1 mg/ml (dexamethasone-21- isonicotinate) | Boheringer Ingelheim | ||
| Rymadil (carprofen) | Pfizer | ||
| Lidocaine clorohydrate 2% | ATI | ||
| Alexa488 dextran | Life Technologies | D22910 |
References
- Strata, P., Rossi, F. Plasticity of the olivocerebellar pathway. Trends Neurosci. 21, 407-413 (1998).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Prog Neurobiol. 72, 373-398 (2004).
- Zipfel, W., Williams, R., Webb, W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, 1369-1377 (2003).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2, 932-940 (2005).
- Sacconi, L., et al. In vivo multiphoton nanosurgery on cortical neurons. J Biomed Opt. 12, 050502 (2007).
- Allegra Mascaro, A. L., et al. In vivo single branch axotomy induces GAP-43-dependent sprouting and synaptic remodeling in cerebellar cortex. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 10824-10829 (2013).
- Ylera, B., et al. Chronically CNS-injured adult sensory neurons gain regenerative competence upon a lesion of their peripheral axon. Curr Biol. 19, 930-936 (2009).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Canty, A. J., et al. Synaptic elimination and protection after minimal injury depend on cell type and their prelesion structural dynamics in the adult cerebral cortex. J Neurosci. 33, 10374-10383 (2013).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Hilliard, M. A. Axonal degeneration and regeneration a mechanistic tug of war. J Neurochem. 108, 23-32 (2009).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Luo, L., O’Leary, D. D. Axon retraction and degeneration in development and disease. Annu Rev Neurosci. 28, 127-156 (2005).
- Chauvet, N., Prieto, M., Alonso, G. Tanycytes present in the adult rat mediobasal hypothalamus support the regeneration of monoaminergic axons. Exp Neurol. 151, 1-13 (1998).
- Morrison, E. E., Costanzo, R. M. Regeneration of olfactory sensory neurons and reconnection in the aging hamster central nervous system. Neurosci Lett. 198, 213-217 (1995).
- Cafferty, W. B., McGee, A. W., Strittmatter, S. M. Axonal growth therapeutics regeneration or sprouting or plasticity. Trends Neurosci. 31, 215-220 (2008).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur J Neurosci. 14, 57-63 (2001).
- De Paola, V., Arber, S., Caroni, P. AMPA receptors regulate dynamic equilibrium of presynaptic terminals in mature hippocampal networks. Nat Neurosci. 6, 491-500 (2003).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49, 861-875 (2006).
- Allegra Mascaro, A., Sacconi, L., Pavone, F. Multi-photon nanosurgery in live brain. Frontiers in neuroenergetics. 2, 21 (2010).
- Rossi, F., van der Want, J., Wiklund, L., Strata, P. Reinnervation of cerebellar Purkinje cells by climbing fibres surviving a subtotal lesion of the inferior olive in the adult rat. II. Synaptic organization on reinnervated Purkinje cells. The Journal of comparative neurology. 308, 536-554 (1991).
- Carulli, D., Buffo, A., Strata, P. Reparative mechanisms in the cerebellar cortex. Progress in neurobiology. 72, 373-398 (2004).
- Grasselli, G., Mandolesi, G., Strata, P., Cesare, P. Impaired sprouting and axonal atrophy in cerebellar climbing fibres following in vivo silencing of the growth-associated protein GAP-43. PLoS One. 6, e20791 (2011).
- Nishiyama, H., Fukaya, M., Watanabe, M., Linden, D. J. Axonal motility and its modulation by activity are branch-type specific in the intact adult cerebellum. Neuron. 56, 472-487 (2007).
- Shinoda, Y., Sugihara, I., Wu, H. S., Sugiuchi, Y. The entire trajectory of single climbing and mossy fibers in the cerebellar nuclei and cortex. Prog Brain Res. 124, 173-186 (2000).
- Strata, P., Tempia, F., Zagrebelsky, M., Rossi, F. Reciprocal trophic interactions between climbing fibres and Purkinje cells in the rat cerebellum. Prog Brain Res. 114, 263-282 (1997).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. (12), (2008).
