A córnea microbolsa Ensaio: Um modelo de angiogênese no mouse Eye
Summary
O protocolo descreve o ensaio de microbolsa corneal conforme desenvolvido em ratinhos.
Abstract
O ensaio microbolsa córnea do rato é um ensaio robusto e quantitativa in vivo para avaliar a angiogénese. A utilização de peletes de libertação lenta padronizadas, contendo factores de crescimento específicos que provocam o crescimento de vasos sanguíneos para a córnea naturalmente avascular, a angiogénese pode ser medida e quantificada. Neste ensaio, a resposta angiogénica é gerada ao longo de vários dias, dependendo do tipo e dose de factor de crescimento utilizado. A indução de neovascularização é normalmente desencadeada por qualquer factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) ou factor de crescimento endotelial vascular (VEGF). Através da combinação destes factores de crescimento com o sucralfato e hídron (poli-HEMA (poli (metacrilato de 2-hidroxietil))) e lançando-se a mistura em grânulos, que podem ser implantados cirurgicamente no olho do rato. Estes peletes uniformes-se lentamente libertar os factores de crescimento ao longo de cinco ou seis dias (bFGF ou VEGF, respectivamente), que permite a resposta angiogénica suficiente necessário para a área do vaso quantification utilizando uma lâmpada de fenda. Este ensaio pode ser usado para diferentes aplicações, incluindo a avaliação de fármacos moduladores angiogénicos ou tratamentos, bem como a comparação entre diferentes origens genéticas que afectam a angiogénese. Um investigador perito depois de praticar este ensaio pode implantar um sedimento em menos de 5 minutos em cada olho.
Introduction
O processo de angiogênese, formação de novos vasos sanguíneos formam os pré-existentes, é altamente complexa e é regulada por vários fatores endógenos que controlam diferentes etapas do surgimento navio e morfogênese. A angiogênese é acionado devido a uma mudança no equilíbrio entre fatores pró e anti-angiogênicos, um equilíbrio que normalmente mantém a vascularização em um estado inativo. A angiogénese ocorre em adultos em determinadas condições fisiológicas tais como durante o ciclo do ovário ou do sexo feminino em processos de reparação, tais como cicatrização de feridas e regeneração de tecidos. No entanto, é também uma característica de várias patologias, incluindo neoplasias, doenças autoimunes e doenças inflamatórias. O envolvimento da angiogênese nestas condições fisiológicas e patológicas torna um assunto importante para a pesquisa e um alvo atraente para a terapia.
Devido à complexidade da angiogênese e do envolvimento de vários cells e fatores no processo, incluindo as células endoteliais, pericitos, células circulantes e células do estroma, in vitro modelos continuam a ser limitados e não pode recapitulam o microambiente única in vivo. A principal ensaios in vitro de angiogênese são amplamente focada na observação de efeitos diretos sobre as células endoteliais e medir determinadas etapas no processo de angiogênese em condições controladas. Estes ensaios incluem a quantificação da proliferação celular endotelial 1, migração 2, a formação da rede 3, a formação do tubo 4 e brotação de esferóides 5. Modelos ex vivo, ao contrário dos in vitro, são mais complexos e incorporar vários tipos de células de tecido, por exemplo, ser o ensaio do anel aórtico 6. No entanto, como os outros sistemas, que podem não captar a contribuição de células circulantes e o estroma natural das células endoteliais como existe in vivo. Tentativaspara estudar a angiogênese sob fluxo para imitar o ambiente in vivo são realizados utilizando sistemas microfluídicos 7, no entanto, mesmo esses ensaios, embora muito melhor, ainda não consegue dar conta de todos os compartimentos existentes in vivo.
Devido às limitações do in vitro, ex vivo e modelos de angiogénese, em modelos in vivo, continuam a ser as escolhas mais fiáveis para estudos de angiogénese. Exemplos destes modelos incluem a implantação de câmaras transparentes, "janelas", que permitem a visualização de vasos sanguíneos que crescem sob microscópio 8, implantes subcutâneos injectáveis, tais como a formação de matrigel e recipiente em tecidos normais, tais como a orelha de rato e da membrana corioalantóica de frango (CAM ). No entanto, um dos modelos de angiogénese in vivo mais aceitáveis e quantitativos é o ensaio de microbolsa neovascularização descrito aqui, o qual explora o naturalmente avascularcórnea como uma "tela" para visualizar e avaliar o novo crescimento angiogênico 9.
Aqui nós descrevemos o ensaio microbolsa córnea desenvolvida em camundongos. Inicialmente, o modelo foi utilizado para medir a estímulos angiogênicos inespecíficos em córneas de coelhos. Isto foi feito através da introdução de peças tumorais no humor aquoso da câmara anterior do olho de coelho e medido a neovascularização induzida por tumores 11.
No entanto, o ensaio foi mais tarde evoluiu para estudar os efeitos de crescimento específico fatores 10 para melhor especificar e padronizar o efeito angiogênico. A fim de libertar o factor de crescimento do olho, peletes de libertação lenta que contêm quantidades conhecidas de factores de crescimento angiogénicos foram usados em vez de tecidos. A disponibilidade de proteínas recombinantes purificadas angiogénicos, tais como VEGF ou bFGF permitiu a sua utilização como alvos específicos de angiogénese modulaters 12. Inicialmente, o ensaio eralargamente utilizado em coelhos, que são mais fáceis de trabalhar devido ao seu tamanho, mas mais tarde o modelo foi traduzido em ratos; um modelo de animais mais pequenos e menos caros. Mudando de coelho para ratos proporcionou uma importante vantagem de ser capaz de usar animais geneticamente manipulados, criando assim uma nova área de pesquisa sobre os componentes genéticos que afetam a angiogênese 13. Além do uso de mais aceitável de ensaio córnea em estudar angiogénese, outros processos biológicos também podem ser investigadas utilizando ensaios modificados. Por exemplo, se tornaram possíveis estudos de lymphangiogenesis através da implantação de baixa dose de pelotas bFGF que permitiu a visualização dos vasos linfáticos por meio de marcadores moleculares específicos 14. Além disso, este ensaio tem fornecido um meio para avaliar os efeitos da radiação na angiogénese 15.
Em suma, o ensaio microbolsa angiogênese corneal é uma quantitativa, reproducible, avaliação flexível de angiogênese in vivo. Uma vantagem principal deste ensaio é que a medição dos vasos de fundo é desnecessário, porque os vasos crescem no tecido avascular naturalmente. Descrevemos aqui o protocolo deste ensaio em detalhes e discutir diferentes cenários que podem ocorrer. O ensaio consiste em três segmentos distintos. A seguir, descreveremos a preparação de peletes de crescimento de factores, inclusive, o implante cirúrgico subsequente e, finalmente, o método utilizado para quantificar o crescimento neovascular resultante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem várias etapas críticas realização de um ensaio de córnea bem sucedido. A primeira é fazer pellets uniformes, capazes de ser implantado e estimular vasos. As partes mais importantes da preparação de pelotas são 1), utilizando o factor de crescimento isento de transportador; 2) garantir uma boa mistura de fator de crescimento com o sucralfato e Hydron e 3) movendo a mistura final rapidamente, mas cuidadosamente do tubo eppendorf à malha, onde as pelotas são lançados. Recomenda-se que os aglomerados de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Kristin Johnson para o trabalho gráfico.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
References
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