Un In vivo La reticolazione Approccio per isolare complessi proteici da Drosophila Embrioni
Summary
Complessi proteici Multi-componenti giocano un ruolo cruciale durante la funzione e lo sviluppo cellulare. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare complessi proteina nativa da embrioni di Drosophila in vivo dopo reticolazione seguita da purificazione dei complessi reticolati per successiva analisi struttura-funzione.
Abstract
Molti processi cellulari sono controllati da complessi proteici multisubunit. Spesso questi complessi formano transitoriamente e richiedono ambiente nativo da montare. Pertanto, per identificare questi complessi proteici funzionali, è importante stabilizzarli in vivo prima lisi cellulare e successiva purificazione. Qui si descrive un metodo utilizzato per isolare grandi complessi proteici in buona fede da embrioni di Drosophila. Questo metodo si basa su embrione permeabilizzazione e stabilizzazione dei complessi all'interno degli embrioni in vivo reticolazione usando una bassa concentrazione di formaldeide, che può facilmente attraversare la membrana cellulare. Successivamente, il complesso proteina di interesse è immunopurified seguita da purificazione gel e analizzato mediante spettrometria di massa. Illustriamo questo metodo utilizzando la purificazione di un complesso proteico Tudor, che è essenziale per lo sviluppo della linea germinale. Tudor è una grande proteina, che contiene più domini Tudor – piccolomoduli che interagiscono con arginine metilate o lysines delle proteine target. Questo metodo può essere adattato per l'isolamento di complessi proteina nativa da organismi e tessuti differenti.
Introduction
Isolamento delle assemblee proteine multisubunit e-DNA o RNA-proteina complessi viene effettuata per identificare complessi proteici, loci genomici riconosciuto da proteine regolatrici che legano il DNA o RNA target di proteine leganti RNA. Diversi metodi permettono l'identificazione genoma dei siti del DNA riconosciuti da fattori di trascrizione o proteine della cromatina (ChIP-Seq) 1 e gli obiettivi di RNA associate a un determinato RNA-binding protein (CLIP-ss) 2. Le librerie di cDNA RNA derivati da o bersagli di DNA sono poi profondamente sequenziati. Questi metodi utilizzano chimica o indotto da UV reticolazione a regolarizzare i complessi seguita da immunoprecipitazione (IP) con un anticorpo contro un componente proteica del complesso studiato.
Durante lo sviluppo di un organismo, molti complessi proteici formano transitoriamente. Pertanto, è fondamentale per analizzare la composizione e la funzione di questi complessi in vivo per comprendere i meccanismi molecolari che controllano development. Tale analisi in vivo sarebbe superiore al metodo in vitro dato che è praticamente impossibile riprodurre concentrazioni nativi dei componenti interagenti e ambiente biochimico cellulare in vitro. Qui mostriamo un approccio in vivo che usiamo con successo per isolare grandi complessi proteici da embrioni di Drosophila. In questo metodo, complessi proteici negli embrioni viventi sono reticolati con una bassa concentrazione di formaldeide e successivamente complessi proteici di interesse sono isolati da IP con un anticorpo contro un componente noto dei complessi seguita da purificazione gel dei complessi e analisi di spettrometria di massa a identificare i componenti complessi sconosciuti. Poiché formaldeide è in grado di permeare la membrana cellulare e ha un raggio di reticolazione 2.3-2.7 Å 3, complessi proteici possono essere reticolati in vivo e le componenti complessi sono suscettibili di essere vicini l'uno all'altro. In questo articolodescrivere questo metodo usando l'isolamento di Tudor (Tud) complesso proteico come esempio. Tud è una proteina germinale che è essenziale per lo sviluppo della linea germinale 4-7. Questa proteina contiene 11 domini Tud noti per interagire con arginines denaturato o lysines di altri polipeptidi 8-10.
In precedenza, abbiamo generato una linea di Drosophila transgenica che esprime HA-tagged funzionale Tud 5 e, quindi, specifici anticorpi anti-HA viene utilizzato per abbattere complesso Tud dopo reticolazione.
Oltre a legami crociati tra proteine, formaldeide può generare acido nucleico reticola-proteina e viene usato in esperimenti di ChIP-seq. Inoltre, in Drosophila, in vivo reticolazione con formaldeide ha permesso l'identificazione di un target di RNA di Vasa RNA elicasi proteine 11.
Mentre in questo articolo descriviamo un metodo per reticolazione in vivo e purria del complessi proteici da embrioni di Drosophila, questo metodo può essere adattato per altri organismi e tessuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La formaldeide è stato comunemente usato come reagente di reticolazione per identificare proteina-proteina e le interazioni proteina-acido nucleico. La sua buona solubilità e permeabilità della membrana cellulare, unitamente alla compatibilità con valle procedure di spettrometria di massa, rendono formaldeide un agente candidato ideale per applicazioni di reticolazione intracellulari 3,15-17. In particolare, è stato usato con successo per identificare mRNA associati Vasa, un critico elicasi RNA di cellul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Jordan Davis, Yanyan Lin, Eric Schadler e Jimiao Zheng per il loro aiuto tecnico con questo studio. Questo lavoro è stato supportato da NSF Career Grant MCB-1054962 a ALA
Materials
| Drosophila agar | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | Other name: TEGOSEPT |
| Population cage | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| Fine nylon mesh | Flystuff (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal |
| Dounce homogenizer | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | D8938-1SET | Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation |
| Protease inhibitor cocktail | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa) | 4693132001 | PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution |
| Anti-HA agarose beads | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | The kit also includes HA-peptide and spin columns |
| HA-peptide | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Prepare to 2 mg/ml with PBS |
| Spin Column | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | Spin columns are included as part of the kit |
| Isopropanol | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP26324 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| Heptane | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use |
| Formaldehyde | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| Glycine | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| Urea | BioRad (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
| 15-ml tubes | USA Scientific (http://www.usascientific.com/) | 1475-0511 | |
| Bleach | Clorox brand | Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach | |
| 50-ml tubes | BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| Top layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| Bottom layer sieve | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
References
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