Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.
Doku morfolojisi muhafaza edilmesi için bir fiziksel bir iskele olmanın yanı sıra, hücre dışı matris (ECM) gelişim ve organ aktif homeostazı sırasında, hücre ve doku fonksiyonlarının düzenlenmesinde yer almaktadır. Bu biyolojik olarak aktif ECM protein fragmanlarının salınmasıyla gibi, biyomekanik biyokimyasal ve biyofiziksel sinyal yollarının, aracılığıyla etki doku gerilimi düzenlemek ve hücre göçü için yollar sağlayarak yapar. Tümör mikro-hücre dışı matris bozulması, birikimi ve fibriler ve fibriler olmayan matris proteinlerinin düzenlenmesi ile karakterize edilen önemli yeniden, maruz kalır. Tümör mikro stromal sertleşmesi tümör büyümesini ve istilasını teşvik, kan ve lenfatik damarların yeniden neden olabilir. Matris proteinlerinin canlı görüntüleme, ancak bu noktaya matris bileşenlerinin çoğunluğu l bırakarak, çoklu foton mikroskopi kullanılarak ikinci harmonik oluşumu ile tespit edilebilir fibril kolajenlerin sınırlıdırargely görünmez. Burada hücre dışı matris proteinleri ve Epifloresans ve iki foton mikroskopi kullanılarak canlı farelerde maruz doku intravital görüntüleme immün, ince dorsal deri, kulak tümör aşılama için işlemleri tarif eder. Bizim intravital görüntüleme yöntemi büyüyen tümör dermal bağlamında fibriler ve fibriler olmayan matris proteinlerinin her ikisinin de doğrudan saptanması için izin verir. Biz yerel matris kasılması neden gemi yeniden örneklerini göstermektedir. Ayrıca, ikinci harmonik oluşumu ile tespit edilen tümör fibriler matris Ayrıca tümör hücreleri ve tümör hücreleri ile T-hücre etkileşiminin uzun süreli (12 saat) gibi görüntüleme gösterdi tenaskin C gibi yeni yatırılan matris bileşenleri uzamsal olarak ayrı olduğu bulunmuştur bazal membran kolajen IV boyunca göç. Birlikte ele alındığında, bu yöntem, benzersiz ata olabilir tümör hücrelerinin eş zamanlı saptanması, fiziksel mikro-ve zaman içinde endojen doku immün tepkisi için, izin verirtümör ilerlemesi ve nihai başarı veya tedaviye direnç altında yatan mekanizmalar içine ide önemli anlayışlar.
Inflamatuar, metastatik ve matriks yeniden süreçlerin Intravital görüntüleme araştırma önemli bir alan olmuştur ve floresan proteinleri 1,2 ifade sayıda transgenik muhabiri fare modellerinin oluşturulması motive etti. Nedeniyle görüntü kalitesini düşürür ve sınırları doku yoluyla nüfuz ışık out-of-focus floresan sinyallerine, görüntüleme kalın doku sadece konfokal veya çoklu foton tarama mikroskobu 3 ile mümkündür. Daha hızlı kullanarak, daha az pahalı ve karmaşık bir epifluorışıma mikroskopi sadece bu tavuk Chorio-allantoik zar 4 ya da 5 fare kulak dermiş olarak yaklaşık iki boyutlu bir doku ile mümkündür. Çoğu görüntüleme sistemleri, hücre tipine özgü bir şekilde çeşitli floresan proteinleri ifade eden transjenik farelerin yararlanmak. Bu proteinler zayıf fototoksisite sunmak olsa da, onlar immün yanıtı 6 neden. Ayrıca, belirli bir hücre alt tipleri arasında geçiş ya da işaretlemek için zordurBöyle bir değişiklik gibi ir bazal veya aktif devletlerin yeni bir genetik modelin hazırlık gerektirir. Floresan protein ifadesi genel olarak hücre içi bölüm ile sınırlandırılmıştır Buna ek olarak, genellikle bazal membran proteinleri ya da doku kemokin mevduat 7 gibi görüntü dışı yapılara mümkün değildir. Bunun yerine, hücre dışı antijenlere karşı antikor ile dolaylı etiketleme hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da belirli matris bileşeninin 8,9 için esneklik sağlar. Bununla birlikte, bu etiketleme yaklaşımın en önemli dezavantajı, kompleman sistemi bağımlı hücre toksisitesi ve hücreler ve hücre dışı yapıların 10 fagositozunun tetikleyebilir antijen-antikor bağışıklık kompleksleri tarafından bağdaştırılan İmmünotoksisite ile ilişkilidir.
Inflamasyon ya da yara iyileşmesi sırasında, hücre dışı, tümör mikro matris, aynı zamanda, normal doku, önemli yeniden şekil alır. Tümör mikro-Stromal sertleştirici promo olabilirnedeniyle stres kaynaklı sinyal mekanizmaları ve kan ve lenf damarlarının 11 nedeni biçimlenme te tümör büyümesi ve işgali. Bununla birlikte, matris proteinlerinin canlı görüntüleme çoklu foton mikroskopi kullanılarak ikinci harmonik oluşumu ile tespit edilebilir fibril kolajenlerin sınırlıdır. Son zamanlarda biz görüntülenmiş hücre ve doku yapılarına 5 fotoğraf ve immün-toksik hasar riskini en aza indiren yeni bir Intravital görüntüleme yöntemi yayınladı. Sürekli intravital görselleştirme bir yuvarlak, 2 saat 30 dakika 12-17 aralığı içinde kurulmuş görüntüleme teknikleri ile karşılaştırıldığında, bizim intravital immünofloresan (IF) tekniği 12 saat (uzun süreli 8) görüntüleme izin verdi. Bu görüntüleme zamanı bizim hayvan protokolde belirlenen limitler nedeniyle 12 saat ile sınırlı ancak bu uzun süreli olamaz hiçbir teknik karşı göstergeler var olduğunu not etmek önemlidir eğer tansiyon ve kalp gibi hayvanın kritik sağlık parametreleri,hızı 8 kontrol edilir. Buna ek olarak, otomatik bir floresan stereomikroskop kullanılarak bir tek bir deney sırasında birden fazla alanlardan görüntü toplamak mümkün ve fonksiyonel kan ve lenf damarları tarafından desteklenen cildin fizyolojik bağlamında meydana gelen nadir immünolojik ve re görülmektedir. Stereomicroscopic lens bir göreceli olarak büyük, 2 cm, çalışma mesafesi vardır ve iki foton mikroskobik optik aksine, su altında buharlaşabilen gerektirmez, çünkü uzun süreli sadece görüntüleme flöresanlı bir stereomikroskop altında gerçekleştirildi. Intravital IF, normal derinin herhangi bir hücre dışı matris bileşeninin bağışıklık etiketleme ve tespit izin verdi. Bu tekniğin tasarımı zararlı etkilere immunotoksik 5 neden olmadan, canlı hücreleri ve cerrahi maruz kalan fare dermis doku matris elemanları için immun boyama kullanarak yenilikçi kavramına dayanmaktadır. Cerrahi prosedür kendisi dermis güvenlisadece bağımsız özerk kan ile beslenen ve ayrı lenfatik dolaşım tarafından drene, innerve kulakta iki cilt katmanlarının ayrılması dayanır gibi damarsal. Bizim deneysel kurulum sağlar, kan ve lenf damarları ve yara iyileşme süreçlerinin arasında lökosit kaçakçılığı olmak üzere en az 12 saat, aşırı önemli pato-fizyolojik olayların bir dizi görüntüleme. Orijinal yayında, biz intravital görüntüleme çeşitli alanlarında state-of-the-art standartlarına bizim teknik karşılaştırdık. Sonuç olarak, ilk lenf damarları 15 toplama yerine beklenen girerek bağışıklık hücrelerinin eşsiz görselleştirilmesi de dahil olmak üzere çeşitli lökositlerin, kan ve lenf damarı ekstravazasyonu intravazasyon etkinlik gözlenmiştir. Ayrıca, diğer gruplar 9,18 tarafından yapılan gözlemler tamamlayan, biz vivo CCL21 toplayarak değil, sadece seyrek ilk lenfatiklerde güçlü, süreksiz mevduat oluşturmak mümkün olduğunu bulundu.
<p class = "jove_content"> Burada bir modifiye Intravital tanımlamak IF ikinci harmonik üretimi (SHG) kullanarak fibrillar kolajenlerin ağını tespit etmek için iki-foton mikroskopi ile kombine edilebilir tekniktir. Bu yöntem aynı zamanda mevcut görüntüleme teknikleri 19 ile büyük ölçüde keşfedilmemiş olan bu tür tenaskin C matris moleküllerini içeren dinamik tümör mikro-, bağlamında görüntüleme, kanser hücresi yayılımını için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tümör fibriler matris, ikinci harmonik oluşumu ile tespit Ayrıca, yerel matris kasılması neden damar yeniden örneklerini tarif uzun tenaskin C. oluşan yeni biriken matris göre tümör mikro farklı yerleri işgal bulundu tümör hücreleri ve bazal membran kolajen IV boyunca tümör hücre göçü ile T-hücre etkileşimleri dönem (12 saat) görüntüleme. Aynı anda kan damarı pe gibi yerel fizyolojik parametreleri kayıt sırasında bu tür olaylar görüntülenebilirrmeability ve lenfatik drenaj.Önem
Burada yüksek çözünürlük ve lifimsi yanı sıra örgü benzeri matriks proteinleri dahil olmak üzere farklı doku mikroçevresinin bileşenleri, dinamik görselleştirme sağlayan bir roman intravital mikroskopi yaklaşım sunmak. (I) intravital flüoresan görüntüleme kan veya lenf eriyik sızıntı izlemek için, örneğin, mikrodolaşım çalışmalarda kullanılmıştır, ancak imüno kombine değil: Bu yöntem, mevcut intravital görüntüleme teknikleri ile karşılaştırıldığı zaman pek çok avantajı vardır. (Ii) genetiği değiştirilmiş muhabiri farelerin kullanılması yansıması için özel hücre türleri için izin verir, ama onların durumunu (veya yenilerini oluşturmak için büyük çaba) gerektirir ve okudu olabilir hücre tiplerini etkileşim sayısını sınırlar. (Iii) Hücre dışı matriks ikinci harmonik kuşak kullanılarak in vivo görüntülü olabilir, ancak bu teknik sadece önemli hücre bileşenleri, çok sayıda bırakarak elyaflı kolajenleri algılayabilirbazal membranların, fibronektinler, tenascins, büyüme faktörleri, kemokin ve güncel araştırma için ulaşamayacağı doku glikozaminoglikanların gibi. Bizim yöntem bu kısıtlamaların üstesinden, ve standart görüntüleme teknikleri büyüme faktörleri (örn. VEGF 26) ve kemokinleri (CCL21 5,18 ve Şek. 2B bağlayıcı diğer hücre tipleri, doku yapıları, heparin sülfat mevduat için immunostainings ile birleşmiş ve daha fazla kombine edilmesini sağlar ), ya da hücre dışı matris proteinleri, aynı zamanda kan ve / veya lenf akışı izleme sırasında.
Sınırlamalar
Intravital IF epifluorışıma görüntüleme kalın hipodermiste (adipoz dokusu) yoksun ince cilt kapakları, sınırlıdır. Biz dorsal kulak dermis teknik kulak dermiş ile sınırlı değildir IF intravital ile kulak deri epifluoresan nispeten zararsız cerrahi maruz için en uygun olan ve potansiyel olarak örneğin uygulanabilir ki bulurkenayak parmakları veya yeni doğmuş fare arka derinin açıkta kalan cilt. Imünofloresansta hızlı antikor boyama (15 dakika) IF pasif difüzyon bağımlı değil ama fonksiyonel lenfatik drenajı ve interstisyel sıvı akışı gerektirir, lenf damarları 27 tıkalı ise dolayısıyla hiçbir lekelenme görülebilir. Bu doğrultuda, lenf damarları güçlü sonra sızan kan damarsal (yaralı gemiler, arteriol) 5. leke. Dorsal ve ventral kulak deri kanatların ayrılması hafif bir cerrahi prosedürdür ancak çeşitli doku hücrelerine bir kılcal ve hücre ölümüne yaralanmasına neden olmaktadır. Örneğin bir hücre sağkalım üzerine ilaçların hafif etkisi bakarak, tamamen sağlam dokuyu araştırmak gerektiğinde bu bir sorun olabilir. Ayrıca fototoksisite ve ağartmanın gelen cildi korumak için hizmet veren antioksidan uygulama doku oksidatif stres veya nitrik oksit biolog örneğin çalışma Intravital immünfloresans tekniğinin kullanılmasını hariçy.
Son olarak, bağışıklık kompleksleriyle doku yerleşik makrofaj kör, bu hücreler ve doku bağışıklık tepkisi ve dendritik hücre aktivasyonunun etkisi, örneğin çalışma aktive edebilir.
Değişiklikler ve sorun giderme
Doku oksidatif stres veya nitrik oksit biyoloji incelemek için, askorbat deneysel çıkışı ile karışmaz diğer doku uyumlu bir ortam ile değiştirilmesi gerekir. Çalışmanın amacı, işlevi ve bağışıklık yanıtı, doku ve dendritik hücre aktivasyonu ve göç aktivasyonu ise ilgili dermal bağışıklık hücreleri üzerinde bloke Fc reseptörleri kaçınılmalıdır. Bu, (F (ab ') 2 antikor fragmanları) veya algılama reaktifleri olarak biyotinile antikor ve fluoresan streptavidin kullanımı yarılır Fc fragmanı ile ikincil antikorun kullanılması ile yapılabilir.
Gelecek uygulamalar
Ayrıca yeni ve benzersiz bir intra mevcutönemli bir IF iki foton mikroskopi kullanılarak tespit SHG-fibriler ve olgunlaşmış kolajenlerin ile kombinasyon halinde transplante deri tümörlerde hücre dışı matrisin görüntü fibriler olmayan bileşenlere tekniği. Epifloresans görüntüleme fazla çoklu foton (veya konfokal) mikroskopi kullanılarak avantajlarından biri, z-istifleme olasılıktır ve sonuç olarak hücre-dışı matris içinde meydana gelen olaylar eş-lokalizasyonu uzamsal, lenf ya da kan damar içine, örneğin, tümör intravazasyon ki durumunda standart epifluorışıma mikroskopi sadece işgalci hücrenin morfolojik değişimler anlaşılabilir. Bu teknik, çok daha geniş bir potansiyele sahiptir. Lenfatik özgü fotodinamik terapi 27 lenfatik tıkanma mekanizmasını araştırmak için IF Örneğin, intravital kullandık. Bu yöntemin ilave potansiyel uygulamalar arasında, ancak nakli reddi veya kan ve lenf yöntemleri iltihabı, bağışıklık mekanizması sırasında cilt incelenmesi ile sınırlı değildir tümörigenez sırasında problemlerle damarı büyümesi.
Prosedür kritik adım
Fizyolojik doku ortamda sürdürülmesi için kritik etkileri vardır en önemli adım dorsal dermis ventral deri ve kıkırdak bir cerrahi ayrılmasıdır. Kesme ya da majör arter veya ven kapatılmasıy tedavileri ve hücre hareketi 8 hücresel yanıtı etkileyecek olan, aşırı kanama ve lokal doku hipoksi yol açacaktır. Cerrahi yapıştırıcı ile kulağını hareketsizleştirir doku ortaya üzerine tutkal dökülüp olarak dikkatle yapılmalıdır kan damarlarının tıkanması ile dokuya kalıcı bir yaralanmaya neden olacaktır. Fare sıcaklığı 37 ° C 'de kontrol ve tutulmalıdır Gözler ve akciğerler düzgün deney sırasında nemlendirilmiş kalmak, böylece Ayrıca, nemlendirilmiş oksijen, izofluran anestezi için kullanılması gerekmektedir. Aynı zamanda, sodyum askorbat, taze hazırlanmalıdır ve pH kullanılmadan önce kontrol edilir.
Özet olarak ntent ">, bu intravital imüno-fare deri kompleks hücresel olayların moleküler görüntüleme ile fizyolojik fonksiyonun gerçek zamanlı, yerel ölçümler köprü oluşturur. kolayca sonrası gelişim, örneğin çalışma uygulanabilir Dahası, bu yöntem, büyük bir potansiyele sahip Kan ve lenf-anjiyogenez veya esneklik ve yüksek verim potansiyeline sahip. çeşitli patojenik ajanlarla cilt enfeksiyonu erken evrelerini görselleştirmek için mekanizmalar, bu intravital tekniği önemli ölçüde biyoloji birden alanlarına katkıda bulunabilir.The authors have nothing to disclose.
Yazarlar görüntü işleme konusunda yardım için Jeremy CM Teo ve S. Ryan Oliver katkılarından ve Jolanta Kilarska minnettarız. Biz iki-foton mikroskobu ile destek için EPFL'deki BIOP çekirdek tesis teşekkür
Bu çalışma, Avrupa Araştırma Komisyonu (DC-Lenf, 206653-2), Avrupa Çerçeve Projesi 7 (AngioScaff), İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31-135756) ve Sağlık US National Institutes hibe tarafından desteklenmiştir (NIH) / NIH Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) (RO1 HL096539). Ayrıca, Robert Wenner Ödülü (İsviçre Kanser Birliği) fonları alım Bu çalışmada kullanılan Leica stereomikroskopta izin verdi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |