A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.
Além de ser um andaime física para manter a morfologia de tecido, a matriz extracelular (ECM) é activamente envolvido na regulação da função das células e dos tecidos durante o desenvolvimento e homeostasia de órgãos. Fá-lo, agindo através de vias de sinalização bioquímicas, biomecânicas e biofísicas, tais como através da liberação de fragmentos de proteínas ECM bioativos, que regula a tensão do tecido, e fornecendo caminhos para a migração celular. A matriz extracelular do microambiente do tumor sofre remodelação substancial, caracterizado por a degradação, deposição e organização das proteínas de matriz fibrilar e não-fibrilares. Estroma endurecimento do microambiente do tumor pode promover o crescimento tumoral e a invasão, e fazer com que a remodelação dos vasos sanguíneos e linfáticos. Imagens ao vivo de proteínas da matriz, no entanto, que este ponto é limitada a colagénios fibrilares que podem ser detectados por uma segunda geração de harmónicas usando microscopia multi-fotão, deixando a maior parte dos componentes da matriz largely invisível. Aqui nós descrevemos os procedimentos de inoculação do tumor na pele dorsal ouvido fino, imunomarcação de proteínas da matriz extracelular e de imagem intravital do tecido exposto em ratos vivos usando epifluorescência e microscopia de dois fótons. O nosso método de imagem intravital permite a detecção directa de ambas as proteínas da matriz fibrilar e não fibrilares no contexto de um tumor em crescimento dérmica. Mostramos exemplos de remodelação navio causadas pela contração da matriz local. Descobrimos também que a matriz fibrilar do tumor detectado com a geração de segundo harmônico é espacialmente distintas das componentes da matriz recém-depositados como tenascin C. Também mostramos a longo prazo (12 horas) de imagens de interação de células T com células tumorais e células tumorais migração ao longo do colágeno IV da membrana basal. Tomados em conjunto, este método permite exclusivamente para a detecção simultânea de células de tumor, o seu microambiente físico e o tecido da resposta imune endógeno ao longo do tempo, o que pode provide importantes insights sobre os mecanismos subjacentes a progressão do tumor e do sucesso ou resistência à terapia definitiva.
Imagens intravital de processos de remodelação inflamatório, metastáticos e de matriz tem sido uma importante área de pesquisa e tem motivado a criação de inúmeros modelos de ratos transgênicos repórter que expressam proteínas fluorescentes 1,2. Devido aos sinais de falta de foco fluorescentes, que reduzem a qualidade de imagem e limites iluminam penetração através do tecido, tecido grosso de imagem só é possível com ou microscopia confocal multi-fotão 3. Usando mais rápido, microscopia de epifluorescência, menos caro e complexo só é possível com os tecidos quase bidimensionais, tais como o frango cório-alantóica membrana 4 ou 5 da orelha de rato derme. A maioria dos sistemas de imagem tirar proveito de ratinhos transgénicos que expressam várias proteínas fluorescentes de uma forma específica do tipo de célula. Embora estas proteínas oferecer fototoxicidade fraco, induzem a resposta imune 6. Além disso, é difícil para alternar entre os subtipos de células específicos, ou marcar abasal ri ou estados ativados como tal mudança exige a elaboração de um novo modelo genético. Além disso, como a expressão da proteína fluorescente é geralmente restrita ao compartimento intracelular, que normalmente não é possível com as estruturas extracelulares de imagem, como as proteínas da membrana basal ou depósitos de quimiocinas tecido 7. Em vez disso, marcação indirecta com anticorpos contra antigénios extracelulares oferece flexibilidade para virtualmente qualquer componente específico de tipo celular ou de matriz 8,9. No entanto, a maior desvantagem desta abordagem está associada com a rotulagem imunotoxicidade mediada por complexos imunes de antigénio-anticorpo que podem provocar toxicidade celular dependente do sistema de complemento e a fagocitose de células e estruturas extracelulares 10.
A matriz extracelular do microambiente do tumor, mas também do tecido normal durante a inflamação ou a cicatrização de feridas, remodelação sofre substancial. Estroma endurecimento do microambiente do tumor pode promoo crescimento do tumor e invasão te devido a mecanismos de sinalização induzida por estresse e causa remodelação de vasos sanguíneos e linfáticos 11. No entanto, imagens em tempo real de proteínas da matriz é limitada a colagénios fibrilares que podem ser detectados por uma segunda geração de harmónicas usando microscopia multi-fotão. Recentemente, publicou um método de imagiologia intravital novela que minimiza o risco de danos e foto-imunológico-tóxicos para as células e estruturas do tecido espelhados 5. Em comparação com técnicas de imagem estabelecidos onde a única rodada de visualização intravital contínua está em um intervalo de 30 minutos a 2 horas 12-17, a nossa imunofluorescência intravital (IF) técnica permitiu 12 horas (de longo prazo) 8 imagem. É importante notar que o tempo de imagem é limitada a 12 horas, devido a limites definidos no protocolo animal, mas não há contra-indicações técnicas que não pode ser prolongada se os parâmetros críticos de saúde do animal, tais como pressão arterial e cardíacataxa são controlados 8. Além disso, por meio de um microscópio estereoscópico fluorescência automatizado fomos capazes de coletar imagens de vários campos durante um único experimento e observou raros processos imunológicos e remodelação que ocorreram no contexto fisiológico da pele apoiado pelo sangue funcional e vasos linfáticos. Porque a lente lupa estereoscópica tem uma relativamente grande, 2 cm, distância de trabalho e em contraste com dois fótons ópticos microscópicos não requer vaporização de imersão em água, a imagem latente de longo prazo foi realizado somente sob fluorescência microscópio estereoscópico. Intravital se permitido a marcação imunológica e a detecção de qualquer componente da matriz extracelular da pele normal. O design desta técnica baseia-se no conceito inovador de usar marcação para as células vivas e elementos de matriz de tecido na derme de rato expostos cirurgicamente sem causar efeitos nocivos imunotóxicos 5. O procedimento cirúrgico é segura para a dermevasculatura, uma vez que se baseia apenas na separação de duas camadas da pele na orelha, que são inervados de forma independente, autônoma alimentada pelo sangue e drenado por circulações linfáticas distintas. Nossa configuração experimental permite imagens de uma série de eventos importantes fisiopatológicas mais de pelo menos 12 horas, incluindo o tráfico de leucócitos entre vasos sanguíneos e linfáticos e os processos de cicatrização de feridas. Na publicação original, comparamos a nossa técnica de state-of-the-art normas em vários campos da imagem intravital. Consequentemente, observou-se o extravasamento de vasos sanguíneos e linfáticos eventos intravasation por vários tipos de leucócitos, incluindo a visualização única de células imunes que entram recolha em vez de esperar vasos linfáticos iniciais 15. Além disso, complementando as observações feitas por outros grupos 9,18, descobrimos que em CCL21 vivo é capaz de formar, depósitos descontínuos fortes sobre a coleta, mas apenas raramente em vasos linfáticos iniciais.
<p class = "jove_content"> Aqui nós descrevemos um intravital modificado IF técnica que pode ser combinado com microscopia de dois fótons para detectar rede de colágenos fibrilares usando geração de segundo harmônico (SHG). Mostra-se que este método também pode ser utilizado para a invasão de células de cancro de imagem em contexto do microambiente tumoral dinâmico, que inclui moléculas da matriz, tais como a tenascina C, que são muito pouco explorado por meio de técnicas de imagiologia correntes 19. Descobrimos que a matriz fibrilar de tumor, detectado com a segunda geração de harmónicas, ocupa diferentes locais do microambiente do tumor do que a matriz depositada de novo composto da tenascina C. Além disso, nós descrevemos exemplos de remodelação navio causadas pela contração matriz local, longa- duração (12 horas), imagiologia de interacções de células T com as células tumorais e a migração de células do tumor ao longo de colagénio IV da membrana basal. Tais eventos podem ser visualizados ao mesmo tempo, o registro de parâmetros fisiológicos locais, como pe dos vasos sanguíneosrmeability e drenagem linfática.Significado
Aqui é apresentado um método de microscopia intravital novela que permite alta resolução e visualização dinâmica de diferentes componentes do microambiente do tecido, incluindo fibrilar, bem como as proteínas da matriz do tipo de rede. Este método possui várias vantagens sobre as técnicas de imagiologia actuais intravital: (i) de imagens de fluorescência intravital tem sido utilizado em estudos de microcirculação, por exemplo, para controlar fugas de soluto a partir do sangue ou no sistema linfático, mas não tem sido combinada com a imunocoloração. (Ii) A utilização de ratinhos repórter geneticamente modificados permite a tipos específicos de células a ser trabalhada, mas requer a disponibilidade (ou esforço substancial para criar novos) e limita o número de interagir tipos de células que podem ser estudadas. (Iii) a matriz extracelular pode ser trabalhada in vivo utilizando segunda geração de harmónicas, mas esta técnica apenas pode detectar colagénios fibrosos, deixando um grande número de componentes extracelulares importantescomo membranas basais, fibronectinas, tenascins, fatores de crescimento, quimiocinas e glicosaminoglicanos do tecido fora do alcance para a pesquisa atual. Nosso método supere essas limitações, e permite que as técnicas de imagem padrão a ser incorporado e ainda combinado com imunomarcações para outros tipos de células, estruturas de tecido, os depósitos de sulfato de heparina fatores de crescimento (por exemplo VEGF 26) e quimiocinas CCL21 (5,18 e fig. 2D vinculativos ,) ou de proteínas de matriz extracelular ao mesmo tempo, de rastreamento de sangue e / ou o fluxo linfático.
Limitações
A imagem de epifluorescência intravital IF se limita aos retalhos de pele fina, privadas da hipoderme de espessura (tecido adiposo). Enquanto nós descobrimos que a derme dorsal da orelha é óptima para a exposição cirúrgica relativamente inofensivos da pele da orelha, com epifluorescência intravital técnica IF não está limitado a derme da orelha e poderia potencialmente ser aplicado a, por exemploa pele exposta dos dedos dos pés ou pele dorsal do rato recém-nascido. Coloração de anticorpos rápida (15 minutos) em imunofluorescência IF não é dependente de difusão passiva, mas requer drenagem linfática funcional e fluxo de fluido intersticial, portanto, nenhuma coloração pode ser observado se os vasos linfáticos são ocluído 27. Em consonância com isso, os vasos linfáticos manchar mais forte vasculatura sangue depois gotejante (vasos feridos, arteríolas) 5. A separação do dorsal e ventral retalhos de pele de ouvido é um procedimento cirúrgico leve mas causa prejuízo a alguns capilares e morte celular para várias células do tecido. Isso pode ser um problema quando é preciso investigar o tecido completamente intacto, por exemplo, olhando para o efeito suave de drogas na sobrevivência celular. Além disso, a aplicação de anti-oxidante que serve para proteger a pele contra a fototoxicidade e fotobranqueamento exclui o uso da técnica de imunofluorescência intravital estudar por exemplo, o estresse oxidativo tecidual ou biolog óxido nítricoy.
Finalmente, ofuscante de macrófagos residentes tecido com complexos imunes podem ativar essas células e influência por exemplo, o estudo do tecido resposta imunológica e ativação de células dendríticas.
Modificações e solução de problemas
A fim de estudar o stress oxidativo tecidual ou biologia de óxido nítrico, o ácido ascórbico tem de ser substituído por outros meios compatíveis com tecidos que não interferem com a produção experimental. Da mesma forma, bloqueando os receptores Fc nas células imunes dérmicas devem ser evitados, se o objetivo do estudo é a função e ativação da resposta imune do tecido e ativação de células dendríticas e migração. Isto pode ser feito com o uso do anticorpo secundário com Fc fragmento clivado (F (ab) 2 de anticorpos) ou o uso de anticorpo biotinilado e estreptavidina fluorescente como reagentes de detecção.
As aplicações futuras
Nós apresentamos um intra novo e únicovital SE técnica para imagem componentes não fibrilares da matriz extracelular em tumores de pele para transplante em combinação com fibrilar SHG-detectados e colágenos amadurecido através da microscopia de dois fótons. Uma das vantagens da utilização de microscopia multi-fotão (ou confocal) ao longo de imagiologia epifluorescência é possibilidade z empilhamento e em consequência espacial de co-localização de eventos que ocorrem no interior da matriz extracelular, por exemplo, intravasamento tumor linfático ou em vasos sanguíneos, o que no caso de microscopia de epifluorescência padrão pode apenas ser inferida a partir de alterações morfológicas na célula invasora. Esta técnica tem um potencial muito mais amplo. Por exemplo, usamos o intravital IF para investigar o mecanismo de oclusão linfático por terapia fotodinâmica específicas de linfático 27. Aplicações potenciais adicionais deste método incluem, mas não estão limitados a investigação de imunidade da pele durante a inflamação, o mecanismo de rejeição ou métodos de sangue e linfa transplante o crescimento dos vasos ATIC durante tumorigênese.
Etapas críticas do processo
O passo mais importante que tem implicações importantes para manter um ambiente de tecido fisiológico é uma separação cirúrgica da pele ventral e dorsal da cartilagem da derme. Cortar ou obstruindo a principal artéria ou veia vai levar a sangramento excessivo e hipóxia tecidual local, o que afetará a resposta celular aos tratamentos e movimento celular 8. Imobilização da orelha com cola cirúrgica deve ser feito com cuidado, como o derrame da cola em expor o tecido vai causar uma lesão permanente no tecido, por oclusão de vasos sanguíneos. A temperatura do rato deve ser controlada e mantida a 37 ° C. Além disso, o oxigénio humidificado necessita de ser usado para a anestesia de isoflurano, de modo que os olhos e os pulmões ficar adequadamente humidificado durante a experiência. Além disso, ascorbato de sódio deve ser preparada imediatamente e seu pH verificados antes do uso.
ntent "> Em resumo, este imunofluorescência intravital pontes em tempo real, medições locais da função fisiológica com imagem molecular de eventos celulares complexas na pele do rato. Além disso, este método tem um grande potencial, pois ele pode ser facilmente aplicada a ex estudo de pós-desenvolvimento mecanismos de sangue e linfa-angiogénese ou para visualizar as fases iniciais da infecção cutânea por vários agentes patogénicos. Com a sua flexibilidade e potencial de alto rendimento, esta técnica intravital pode contribuir significativamente para várias áreas da biologia.The authors have nothing to disclose.
Os autores são gratos a Jeremy CM Teo e S. Ryan Oliver por sua contribuição e Jolanta Kilarska ajuda no processamento de imagem. Agradecemos a facilidade núcleo BIOP na EPFL pelo apoio com microscopia de dois fótons
Este trabalho foi apoiado em parte por doações da Investigação da Comissão Europeia (DC-linfa, 206653-2), o Projeto Quadro Europeu de 7 (AngioScaff), a National Science Foundation suíço (31-135756) e os Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos (NIH) / NIH Coração, Pulmão e Sangue (NHLBI) (RO1 HL096539). Além disso, os fundos do Wenner Prêmio Robert (Swiss Cancer League) permitiu a aquisição do microscópio estereoscópico Leica utilizado neste estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Mice Strain | |||
BALB/C mice (8-12 weeks ) | Charles River | Orleans,France | |
C57/Bl6 Mice (8-12 weeks ) | Harlan | Carshalton UK | |
Cell Line | |||
B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP | |||
Anesthesia Maintenance | |||
Isofluorane | Minrad Inc. | 2222 | Minrad Inc., Buffalo, NY |
Humidified delivery system | Rothhacher GmBH | Berne, Switzerland | |
DC Temperature Control System | FHC Inc | Bowdoin, MA | |
Stereomicroscope | |||
Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage . | M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
1× lens (linear system magnification from 7.5× to 160×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
2× lens (linear system magnification from 15.6× to 320×) | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
Multiphoton Microscopy | |||
LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage | Leica Microsystems CMS GmbH | Wetzlar, Germany | |
HCX APO 20x/1.2 oil immersion | |||
Chameleon Ultra Laser | |||
Reagents | |||
Ringer's buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate) | B. Braun Medical AG | 445968 | Sempach, Germany |
Aprotinin | Elastin | AP92 | Owensville, MO |
Thrombin | Sigma-Aldrich | T7326-1KU | Taufkirchen, Germany |
Sodium ascorbate | Sigma-Aldrich | 11140-50G | Taufkirchen, Germany |
Mouse Serum raised against human IgG | Abcam | ab34834 | Cambridge, UK |
Collagen IV | Abcam | AB6581 | Cambridge, UK |
Perlacan | RnD | ab79465 | Minneapolis, MN |
Tenascin C | RnD | AF3358 | Minneapolis, MN |
Podoplanin | RnD | AF3244 | Minneapolis, MN |
LYVE-1 | Reliatech | 103-PA50 | Wolfenbüttel, Germany |
CCL21 | RnD | AF457 | Minneapolis, MN |
Streptavidin Pacific Blue | Invitrogen | S11222 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 647 | Invitrogen | S21374 | Grand Island, NY |
Streptavidin Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Goat 594 | Invitrogen | A21113 | Grand Island, NY |
Donkey Anti Rabbit 594 | Invitrogen | A21207 | Grand Island, NY |
CMTPX CellTracker | Lifetechnologies | C34552 | Carlsbad, California |
Histocryl (surgical glue) | Braun Aesculap | 1050060 | Tuttlingen, Germany |
Cell Culture Reagents | |||
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM | Gibco Invitrogen | E15-843 | Grand Island, NY |
Fetal bovine serum (FBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY | |
Trypsin | Gibco Invitrogen | 25300062 | Grand Island, NY |
PBS | Gibco Invitrogen | Grand Island, NY |