Summary

Hamilelik sırasında Sıçan Karaciğer dokusunda yağ asitleri arasında kompozisyon değişiklikleri analiz Gaz Kromatografi Kullanımı

Published: March 13, 2014
doi:

Summary

Gebelik maternal dokuların yağlı asit bileşimine önemli değişikliklere yol açmıştır. Lipid profilleri sıçanlarda, kimlik ve tek tek lipid sınıflarında yağlı asitlerin ölçümü gebelik sırasında çeşitli yüksek ve düşük yağlı diyetler beslenmiştir izin vermek için gaz kromatografisi ile elde edilebilir.

Abstract

Gaz kromatografisi (GC), yüksek hassasiyet ve yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile sonuçlar alındı, dokular, hücreler ve plazma / serum Lipidlerin yağlı asit içeriğini belirlemek ve ölçmek için kullanılan bir çok hassas bir yöntemdir. Metabolik ve beslenme çalışmaları GC sağlar müdahaleleri aşağıdaki yağ asidi konsantrasyonlarında veya gebelik gibi fizyolojik durumuna değişiklikleri sırasında değişikliklerin değerlendirilmesi. Aminopropil silis kartuşları kullanılarak katı faz ekstraksiyon (SPE) sağlar Triasilgliserollerin, farklı fosfolipidler ve kolesteril esterleri (CE) de dahil olmak üzere başlıca lipid sınıflarının ayrılması. SPE ile birlikte GC çeşitli yüksek ve düşük yağlı diyetler ile beslenmiş olan bakir ve hamile sıçanların karaciğerlerinde CE fraksiyonun yağ asidi bileşimi değişiklikleri analiz etmek için kullanıldı. Karaciğer CE omega-3 ve omega-6 yağ asit içeriği üzerine önemli beslenme / gebelik etkileşim etkileri hamile kadın diyet manipulat farklı bir tepki olmadığını belirten vardırdaha iyon bakire kadınlarda görülür.

Introduction

Gaz kromatografisi (GC) takviyesi veya fizyolojik obezite gibi koşullarda (ve diyabet gibi ilişkili hastalıklar) veya gebelik süresince 3 lipid havuzları ve hücre zarları 1,2 yağ asitlerinin dahil edilmesini belirlemek ve ölçmek için kullanılan bir köklü bir tekniktir – 5. Ayrıca, gıdalarda türleri ve yağların miktarları analiz için uygundur. Deneysel diyetler karakterize yanı sıra, gıda sanayi yönetmeliklerine uygunluğunu sağlamaya yararlıdır. Örneğin, GC etiketleme doğru olan ve düzenlemelerin, 6,7 yapıştırılır sağlamak için bir besin takviyesi olarak bir ürün içinde kimlik ve yağ asitlerinin miktarını doğrulamak için kullanılabilir. Yağ asitlerinin Analizi sağlığı ve hastalıkları, diyet değişikliği etkisi ve fizyolojik durumuna 8 değişikliklerin etkisi lipid metabolizması içine değerli bilgiler sağlayabilir. Gebelikte örnekleri çalışmak için GC kullanımı önemli sağladıyağ asidi ve kompleks lipid homeostazı 3 değişiklikler hakkında bilgi.

Kromatografik ayırma öncesinde, yağlar, genellikle kloroform ve metanol çözücü karışımları lipidlerin çözünürlüğünü kullanarak numuneden ekstre edilmiştir. Sodyum klorür fazları 9,10 ihtiva eden sulu ve organik lipid olarak karışımın ayrılmasını kolaylaştırmak üzere eklenir. Ilgi Kompleks lipid sınıfları, katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile, toplam lipid ekstreden ayrılabilir. Bu ayırma işlemi, teknik polaritelerine veya bağlanma afinitesine bağlı olarak lipid sınıfları çözülür. Triacyglycerols (TAG) ve kolesteril esterleri (CE) kombine bir fraksiyon, bundan başka sınıfları, fosfatidilkolin (PC) gibi ilk önce elüte edilir, fosfatidiletanolamin (PE) ve esterleşmemiş yağ asitlerinin (NEFA) yıkama çözücünün artan polarite ile taşınacağı . CE gelen TAG ayrılması sadece taze bir SPE cartri için TAG bağlanma yararlananDGE, CE elüt edilmesi için izin verir. TAG daha sonra elüsyon solvent 9,10 polaritesinin artırılması ile elüte edilebilir. Bu yöntem, daha yüksek bir verim ile eş zamanlı olarak ayrılması için çok sayıda örnek, nispeten küçük boyutlu örnekler (örneğin <100 ul plazma ya da serum, <100 mg doku) 11,12 analiz edilebilir, yani, ince tabaka kromatografisi ile elde edilmesine izin verir.

GC ilk olarak 1950 de tarif edilen bir köklü bir tekniktir, bu daha sonra, sıvı-sıvı sistemlerinde, mobil faz, buhar ile değiştirilebilir önerildi. Bu, ilk olarak petrol analizi için kullanılabilir, ancak bu tür hızlı bir şekilde, amino asit analizi ve büyük ilgi halen lipid biyokimya gibi başka alanlara genişletilmiştir. Örneğin daha önce kullanılan paketlenmiş sütunlar kılcal sütun gelişme olarak GC ekipman ve teknolojisindeki gelişmeler, yağ asitleri için mümkün olduğu mevcut tekniklere açmıştırGC rutin araştırmalar 13 arasında geniş bir aralıkta yağlı asitleri belirlemek ve ölçmek için kullanılan ile sonuçlanan daha düşük sıcaklıklarda daha verimli bir şekilde ayrılır.

GC bunlar termal ayrışma olmadan, makul sıcaklıklarda elüt için yeterince uçucu olabilir bu sırayla türetilebilir için yağ asitleri gerektirir. Bu analiz için, genellikle esterler, tiyoesterler veya amidleri oluşturmak için hidrojen içeren fonksiyonel bir grubun ikamesi içerir. Metil esterleri yaygın metilasyon tarafından üretilen türevleri, incelenmiştir. Bu yöntemde, kompleks lipidler içindeki ester bağları yağlı asit metil esterleri (FAME) oluşturmak için transmethylated olan serbest yağ asitlerini, serbest bırakmak için hidrolize edilmektedir. GC ile belirlendi FAME profili elde edilen, yağlı asit bileşimi olarak adlandırılır ve kolay bir şekilde farklı deney grupları 9,10 arasında karşılaştırılabilir. Teknik olanak Tek sıralamada oranlarını hemual yağ asitleri ve bunların konsantrasyonları, ölçülecek.

Beslenme çalışmalarında ve gıda endüstrisi içinde yağ asitleri analiz etmek için GC kullanımına ek olarak, teknik, analitik alanlarda geniş bir aralığında kullanılabilir. Örneğin, GC kullanılarak çevre analizleri böcek ve toprak su kirlenmesini ölçme içerir chlorobenzene içeriğini ölçme analiz eder. Toksikoloji, GC de idrar ve bireylerin kan örneklerinde yasadışı maddeleri tanımlamak için kullanılır olmuştur, bu tür bir spor performans artırıcılar 12 ve hidrokarbonların kompleks karışımlarını ayırmak için yeteneği petrokimya analizi 12 için petrol sektöründe bu tekniği popüler hale getirir.

Gebelik, özellikle omega-3 içeriği maternal dokuların yağlı asit bileşimine önemli bir değişiklik, (n-3) ve omega-6 (n-6) çoklu doymamış yağ aci ile ilişkilids (PUFA) 3. Mevcut çalışmada, farklı yağ kaynakları ile, düşük ve yüksek yağlı diyet ile beslenmiştir bakir ve hamile sıçanlardan alınan karaciğer dokusu yağlı asit bileşiminin analizinde kullanımını açıklayan yağ asitlerinin ölçümünde GC kullanımını örnekler. Burada sağlanan deneysel diyetler, düşük yağlı soya yağı bazlı diyet, yüksek yağlı soya yağı bazlı diyet (130.9 g toplam yağ / kg toplam yağ) veya yüksek yağ bezir yağı bazlı diyet (130.9 g toplam yağ / kg idi 20 gün için sağlanan beslenme). Bu diyetler tam besin ve yağlı asit bileşimi, daha önce 14 tarif edilmiştir. Soya fasulyesi yağı diyeti linoleik asit (18:2 n-6) açısından zengindir ve keten tohumu yağı diyeti, α-linolenik asit açısından zengin iken, bir α-linolenik asit (18:03 n-3) içerir. Bu yüksek-yağlı diyetler, linoleik α-linolenik asit için (sırasıyla, 8:01 ve 01:01 arasında katyonları), farklı yem oranlarını temsil eder. Bireysel lipid sınıfları ve GC ile analiz izolasyonu için bir yöntem olup bizll oluşturulmuş ve valide, ve daha önce 10 ama burada bulunan ayrıntılı teknik açıklama olmadan yayımlanmıştır.

Protocol

1.. Hayvan Prosedürleri Tüm hayvan çalışmaları Home Office Hayvanlar (Scientific Procedures) Act (1986) göre yapılmalıdır. Tekeşli ıslah tarafından eski 10 hafta arası Wistar sıçan Mate, ve vajinal tamponun görünümü ile gebelik onaylayın. Gebelik günü 1 olarak kaydedin, ve deneysel diyet başlar. Bakire kadın için, tek tek her bir sıçan ev ve deneysel diyet başlar. 20 gün boyunca deney diyetlerinin besleme sonra servikal dislokasyon takiben CO2 ile b…

Representative Results

Bu yöntemin başarısı tam protokolü takip ve "gürültü" ve kromatogramda görünebilir kirlenmesini azaltmak amacıyla temiz çözücüler ve reaktifler kullanılarak bağlıdır. Kirlenmiş örnekleri eğri hesaplamaları altındaki alanın doğruluğunu düşürücü, analiz etmek için daha zor bulunmaktadır. Açık protokol simetrik, iyi tanımlanmış zirveler ve minimal arka plan gürültüsü ile başarılı bir kromatogramını takip edilirse, Şekil 3'te gösterildiği gibi…

Discussion

Gaz kromatografisi yağlı asit analizi için kullanılacak doğru bir tekniktir, ve yüksek tekrarlanabilirliği klinik analizler için müsait bu tekniği görmektedir. Uygun GC sütun mevcut sütun durağan faz, kolon uzunluğu ve iç çapı polaritesine varyasyonlara sahip olan, ilgi konusu olan yağlı asitleri tanımlanmasını sağlamak için kullanılmalıdır. Bu analiz yönteminde, bir kaynaşık silika kılcal kolonunun kullanılması, iyi bir termal stabilitesi ve yüksek yüzey inertlik ve iyi çözünürl?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar sıçan çalışmaya Meritxell Romeu-Nadal katkısını kabul etmek istiyorum.

Materials

Methanol: Fisher Scientific M/4056/17 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Chloroform: Fisher Scientific C/4966/17 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
BHT: Sigma- Aldrich W218405 'CAUTION' Dust fumes – Anhydrous
NaCl Sigma- Aldrich S9888 Anhydrous
Hexane Fisher Scientific H/0406/17 'CAUTION' Fumes – HPLC Grade
Glacial acetic acid Sigma- Aldrich 695084 'CAUTION' Burns – 99.85%
Sulfuric acid Sigma- Aldrich 339741 'CAUTION' Burns – 99.999%
Potassium carbonate Sigma- Aldrich 209619 99% ACS Reagent grade
Potassium bicarbonate Sigma- Aldrich 237205 99.7% ACS Reasgent grade
Ethyl acetate Fisher Scientific 10204340 'CAUTION' Fumes – 99+% GLC SpeciFied
Toluene Fisher Scientific T/2300/15 'CAUTION' Fumes
Diethyl ether Sigma- Aldrich 309966 'CAUTION' Fumes
Nitrogen (oxygen free) cylinder BOC 44-w 'CAUTION' Compressed gas – explosion risk
Aminopropyl silica SPE cartridges Agilent 12102014 Cartridge – Bead mass 100mg
Silica gel SPE cartidges Agilent 14102010 Cartridge – Bead mass 100mg
Molecular seives Sigma- Aldrich 334324 Pellets, AW-300, 1.6mm
Glass pasteur pipettes Fisher Scientific FB50251
Borosilicate glass test tube Fisher Scientific FB59527 Non-screw cap
Screw thread glass test tubes Fisher Scientific FB59555 13mm
Caps for screw thread test tubes Fisher Scientific FB51353 To fit 13mm tube
Solida phase extraction (SPE) tank Agilent VacElut 20 Manifold
Luer stopcocks for SPE tank Agilent 12131005
Vacuum pump Sigma- Aldrich 2656-194GB-1EA
GC vials Kinesis STV 12-03TS Short thread 9mm, TPX 0.2ml fused glass insert
GC vial lids Kinesis SCC09-0.2B Short thread 9mm blue
GC inlet liners SGE Analytical science 092002 Split/splitless Focus liner ID 4mm, OD 6.3mm length 78.5mm
GC septa SGE Analytical science 041856 11mm, MN material
GC column SGE Analytical science 054612 Length 30m, ID 0.22mm, Film thickness 0.25µm
Gas chromatograph HP 6890 series

References

  1. Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
  2. Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
  3. Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
  4. Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
  5. Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
  6. Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
  7. Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
  8. Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
  9. Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
  10. Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
  11. Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. . Quantitative chromatographic analysis. , (2000).
  12. Bartle, K. D., Myers, P. History of gas chromatography. Trends Anal. Chem. 21 (9), 9-10 (2002).
  13. Childs, C. E. . The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , 378 (2008).
  14. Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
  15. Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).

Play Video

Cite This Article
Fisk, H. L., West, A. L., Childs, C. E., Burdge, G. C., Calder, P. C. The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy. J. Vis. Exp. (85), e51445, doi:10.3791/51445 (2014).

View Video