Измерение спинного пресинаптического торможения у мышей, спинных потенциального записи<em> В Vivo</em
Summary
ГАМКергических пресинаптического торможения является мощным ингибирующим механизм в спинном мозге важной для двигателя и интеграции сенсорного сигнала в спинного мозга сетей. Базовая первичных афферентных деполяризация может быть измерена путем записи дорзальных корешков потенциалов (DRP). Здесь мы показываем, способ записи в естественных условиях DRP у мышей.
Abstract
Пресинаптического торможения является одним из самых мощных тормозных механизмов в спинном мозге. Основной физиологический механизм является деполяризация первичных афферентных волокон, опосредованных GABAergic аксо-аксонов синапсов (первичных афферентных деполяризации). Сила первичных афферентных деполяризации может быть измерена путем записи объемных потенциалов-проведены на задних корешков (задних корешков потенциалы, DRP). Патологические изменения пресинаптического торможения имеют решающее значение в ненормальном центральной обработки определенных условиях боли и при некоторых нарушениях двигательной возбудимости. Здесь мы описываем метод записи DRP в естественных условиях у мышей. Подготовка спинного мозга спинной корни в анестезированной животных и процедуры записи, используя всасывающие электроды объясняются. Этот метод позволяет измерять GABAergic DRP и тем самым оценки спинного пресинаптического торможения в живом мыши. В сочетании с трансгенных мышиных моделях, DRP съемка может себеRvE в качестве мощного инструмента для расследования связанных с заболеванием спинного патофизиологии. В естественных условиях записи имеет ряд преимуществ по сравнению с бывшими естественных условиях изолированных препаратов спинного мозга, например возможностью одновременной записи или манипуляции супраспинальных сетей и индукции DRP путем стимуляции периферических нервов.
Introduction
Пресинаптического торможения является одним из самых мощных тормозных механизмов в спинном мозге. Он подавляет возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП) в моносинаптически возбужденных мотонейронов без изменения постсинаптическую мембранный потенциал и возбудимость мотонейронов 1-3. Первичная деполяризации афферентных (PAD), индуцированный GABAergic аксо-аксонов синапсов на сенсорных пресинаптических волокон является основной механизм 4-7 (см. также Figure1a). Эти синапсы содержат ГАМК-и ГАМК B-рецепторы (ГАМК R и ГАМК B R). ГАМК R активность приводит к увеличению хлоридной проводимости, вырабатывающий PAD связи с локальным распределением ионов. Эта деполяризация блокирует распространение потенциалов действия в аксонов и снижает их прочность приводит к снижению Ca 2 +-приток и сокращение выпуска передатчика. Активация ГАМК B рецепторами делает нетт способствовать PAD но приводит к снижению Са 2 +-притока тем самым повышая пресинаптического торможения. В то время как активация ГАМК A R-видимому, участвует в короткий срок торможения, ГАМК B R участвуют в долгосрочной модуляции 8-10. В дополнение к ГАМК, на долю которого приходится большая часть PAD и пресинаптического торможения, другие системы передатчики могут также модулировать и свой вклад в этот механизм 11,12.
Патологические изменения в пресинаптического торможения, кажется, решающее значение в нескольких болезненных состояний, например, периферийное воспаление и нейропатической боли 13,14, а также аномальные обработку центральный болевой 15, травмы спинного мозга 16 и поражение ЦНС с моторной возбудимости посредничестве дефектной передачи ГАМКергической 17, 18. Таким образом, оценивая пресинаптического торможения стоит исследовать экспериментальные патологических состояний на уровне спинного мозга в естественных условиях </em>. PAD приводит к объемных потенциалов, обеспечивающих проведено прямое измерение пресинаптической торможения в спинном мозге. Эти потенциалы называются заднекорешковых потенциалов (DRP) и может быть измерена с спинномозговых корешков шнур спинных после стимуляции соседних спинной корни 7.
Первые измерения DRP были зарегистрированы в кошек и лягушек 19 и интенсивно изучались в кошках по Эклс, Шмидта и др. в начале 1970-х годов 3,4,20,21. В то время как естественных условиях записи в DRP из 22 кошек и крыс 23 широко используются измерения на мышах были почти исключительно выполнены в Экс Vivo изолированных препаратах спинного мозга 15,24. Здесь мы опишем метод для записи DRP под наркозом мышей в естественных условиях, позволяя прямое измерение пресинаптического торможения в здоровом организме.
Protocol
Representative Results
Discussion
Дополнительные-и внутриклеточных электрофизиологических записи нейронной активности и синаптических потенциалов в естественных условиях являются состояние техники искусства в расследовании функции нейронов ЦНС и патофизиологии. Спинной интеграция имеет решающее значение дл…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Манфред Heckmann за полезные обсуждения в ходе создания метода. Кроме того, мы благодарим Клаудию Sommer для оказания технической помощи и Фрэнк Шуберт для поддержки производства видео. Работа выполнена при поддержке Федерального министерства образования и научных исследований (BMBF), Германии, ФКЗ: 01EO1002 и Междисциплинарного Центра клинических исследований (IZKF) Йенского университета больнице.
Materials
| Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
| Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
| (Melsungen, Germany) | |||
| Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
| Ketamin 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
| 30G micro needle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
| (Melsungen, Geramny) | |||
| Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
| S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
| Stimulator | |||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
| InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
| Data acquisition | |||
| Universal amplifier | npi (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
| Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
| Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
| Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
| Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |
References
- Eccles, J. C., Eccles, R. M., Magni, F. Central inhibitory action attributable to presynaptic depolarization produced by muscle afferent volleys. J. Physiol. 159, 147-166 (1961).
- Levy, R. A. The role of gaba in primary afferent depolarization. Prog. Neurobiol. 9, 211-267 (1977).
- Eccles, J. C., Magni, F., Willis, W. D. Depolarization of central terminals of Group I afferent fibres from muscle. J. Physiol. 160, 62-93 (1962).
- Eccles, J. C., Schmidt, R., Willis, W. D. Pharmacological Studies on Presynaptic Inhibition. J. Physiol. 168, 500-530 (1963).
- Maxwell, D. J., Bannatyne, B. A. Ultrastructure of muscle spindle afferent terminations in lamina VI of the cat spinal cord. Brain Res. 288, 297-301 (1983).
- Barber, R. P., Vaughn, J. E., Saito, K., McLaughlin, B. J., Roberts, E. GABAergic terminals are presynaptic to primary afferent terminals in the substantia gelatinosa of the rat spinal cord. Brain Res. 141, 35-55 (1978).
- Wall, P. D., Lidierth, M. Five sources of a dorsal root potential: their interactions and origins in the superficial dorsal horn. J. Neurophysiol. 78, 860-871 (1997).
- Rudomin, P. In search of lost presynaptic inhibition. Exp. Brain Res. 196, 139-151 (2009).
- Rudomin, P., Schmidt, R. F. Presynaptic inhibition in the vertebrate spinal cord revisited. Exp. Brain Res. 129, 1-37 (1999).
- Kullmann, D. M., et al. Presynaptic, extrasynaptic and axonal GABAA receptors in the CNS: where and why?. Prog. Biophys. Mol. Biol. 87, 33-46 (2005).
- Hochman, S., Shreckengost, J., Kimura, H., Quevedo, J. Presynaptic inhibition of primary afferents by depolarization: observations supporting nontraditional mechanisms. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 140-152 (2010).
- Thompson, S. W., Wall, P. D. The effect of GABA and 5-HT receptor antagonists on rat dorsal root potentials. Neurosci. Lett. 217, 153-156 (1996).
- Enriquez-Denton, M., Manjarrez, E., Rudomin, P. Persistence of PAD and presynaptic inhibition of muscle spindle afferents after peripheral nerve crush. Brain Res. 1027, 179-187 (2004).
- Wall, P. D., Devor, M. The effect of peripheral nerve injury on dorsal root potentials and on transmission of afferent signals into the spinal cord. Brain Res. 209, 95-111 (1981).
- Witschi, R., et al. Presynaptic α2-GABAA Receptors in Primary Afferent Depolarization and Spinal Pain Control. J. Neurosci. 31, 8134-8142 (2011).
- Calancie, B., et al. Evidence that alterations in presynaptic inhibition contribute to segmental hypo- and hyperexcitability after spinal cord injury in. 89, 177-186 (1993).
- Geis, C., et al. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
- Geis, C., et al. Human IgG directed against amphiphysin induces anxiety behavior in a rat model after intrathecal passive transfer. J. Neural Transm. 119 (8), 981-985 (2012).
- Barron, D. H., Matthews, B. H. The interpretation of potential changes in the spinal cord. J. Physiol. 92, 276-321 (1938).
- Schmidt, R. F., Trautwein, W., Zimmermann, M. Dorsal root potentials evoked by natural stimulation of cutaneous afferents. Nature. 212, 522-523 (1966).
- Eccles, J. C., Schmidt, R. F., Willis, W. D. Presynaptic inhibition of the spinal monosynaptic reflex pathway. J. Physiol. 161, 282-297 (1962).
- Manjarrez, E., Rojas-Piloni, J. G., Jimenez, I., Rudomin, P. Modulation of synaptic transmission from segmental afferents by spontaneous activity of dorsal horn spinal neurones in the cat. J. Physiol. 529 Pt 2, 445-460 (2000).
- Geis, C., et al. Human Stiff-Person Syndrome IgG Induces Anxious Behavior in Rats. PLoS One. 6, e16775 (2011).
- Martinez-Gomez, J., Lopez-Garcia, J. A. Electrophysiological and pharmacological characterisation of ascending anterolateral axons in the in vitro mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 146, 84-90 (2005).
