一种改进<em>在体外</em>入侵检测，以确定激素，在调节肿瘤细胞侵袭的细胞因子和/或生长因子的潜在作用
Summary
This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.
Abstract
血清作为趋化对其中的癌细胞迁移和侵袭，促进他们的血管内进入微血管。然而，实际的分子朝向该细胞迁移仍然无法实现。本变形侵袭实验已经开发，以确定哪一个驱动器细胞迁移和侵袭的目标。这种技术比较下三个条件的侵袭索引，以确定是否一个特定的激素，生长因子，细胞因子或在介导癌细胞的侵袭性潜力的作用。这些条件包括：i）正常牛胎儿血清（FBS），ⅱ）活性炭处理的FBS（CS-FBS）的功能，从而激素，生长因子，以及细胞因子和iii）的CS-FBS +分子（表示为“X”）。相比FBS细胞侵袭与CS-FBS的显著的变化，表明激素，细胞因子和生长因子介导的变化的参与。各个分子然后可以重新添加到CS-FBS以测定他们的重新能力诗句或抢救入侵表型。此外，两个或更多的因素可以结合，以评估该添加剂或多种分子在驾驶或抑制侵袭协同效应。总体而言，该方法能够使研究者确定是否激素，细胞因子，和/或生长因子通过作为化学引诱物或侵入的抑制剂为特定类型的癌细胞的或特定的突变体在细胞侵袭的作用。通过识别特定的趋化因子和抑制剂，这个修改后的入侵检测可能有助于阐明信号通路，直接癌细胞侵袭。
Introduction
一种新颖的侵袭实验研制了具有确定具体激素，细胞因子和/或生长因子如癌细胞侵袭化学引诱物的参与的目标。肿瘤细胞侵入通过细胞外基质（ECM）的能力，是在转移表型1-3的一个标志。入侵室已被广泛用作体外的工具来研究癌细胞的侵袭和转移，并可以提供知识， 体内肿瘤的侵袭和转移的机制。 腔室包括嵌套细胞培养板的孔中的圆柱形的细胞培养插入物。插入件的底部是限定孔径的半透聚碳酸酯或聚苯乙烯膜。
在标准侵袭实验，将细胞接种到在插入膜用无血清培养基，并置于细胞培养孔被填充有血清或血清样化学引诱物送等了一个趋化的力量。移动至该力驱动细胞通过的半透膜（迁移）或可替代地，通过细胞外基质（侵入），然后可以使用常规的染料检测和定量细胞数染色的涂层。细胞数，然后根据迁移和侵袭的非侵入性的细胞系的范围内归一化。此方法允许研究者评估在各种条件，包括遗传操作不同类型的细胞的侵袭性潜力。
激素，细胞因子和生长因子是血清的关键组成部分，并越来越多地被示出为与驱动侵袭性表型4相关联。然而，在自然界，角色，和特异性这些趋化血清分子仍然介导入侵仍然无法实现。我们面临的挑战仍然是确定哪些具体因素血清或血清样趋化因子负责驾驶癌细胞侵袭以及什么分子可以抑制入侵过程。在这份报告中，我们描述了一种方法来评估潜在激素，细胞因子和/或血清中存在的生长因子的参与，如分子找到癌细胞的趋化和侵袭。
在此提出的改性协议，木炭剥离用于去除激素，细胞因子和生长因子，由2％胎牛血清（FBS），以产生2％的活性炭脱色的FBS（CS-FBS）。两个2％FBS和2％CS-FBS的被用作试剂来建立趋化力来驱动癌细胞侵袭。用2％CS-FBS的作为相比于正常的2％FBS的趋化剂能提供若干好处，包括第一，最突出的是，以研究在减少/相对缺乏激素，细胞因子和生长因子的癌症侵袭的表型的能力。它还使研究者评估是否集体去除激素，生长因子，以及CYtokines引起侵袭性指数的增加或减少。该测定然后设计，以确定是否增加一个单独的组件，被指定为“X”，可以抑制，减少，增加，或侵入索引恢复到原来的值（参见图2和3）。虽然这种方法是具体用于实现生理水平是从血清中木炭提除去的组件，还应当注意的是，木炭汽提也可以影响信号转导途径。例如，已经报道，木炭剥离能降低骨祖细胞的碱性磷酸酶活性，并通过减少MAPK活化剂5的诱导脂肪生成。木炭剥离介质是可商购，并且基于协议概述，结合木炭与葡聚糖和孵育胎牛血清O / N 6。
该测定是在respo开发NSE到报告的Zucker 等人 7的结果的作者证明朝向媒体与正常的2％FBS的迁移时的突变体的表型影响间隙连接通讯证明增加的侵袭索引。这一增长与活性炭处理血清替代被淘汰。从该结果中，作者得出结论认为，这种突变影响朝向亲脂性分子迁移（更具体地，激素，生长因子，细胞因子或）7。它公知的是激素，生长因子和细胞因子介导的信号参与肿瘤促进和侵入4通路。因此，对于科学调查，以确定哪些因子（S）的驱动的肿瘤侵袭其特定的癌细胞或突变体的研究之中是重要的。该试验的目的是为解决在其生理浓度各组分的作用，因为，根据该成分的浓度之间的差来确定与在正常的FBS和CS-FBS的X“;＃8220。通过此法的发展，研究人员可以更深入地了解具体的侵入途径管理他们的系统。
激素，生长因子，和细胞因子经常被归类为促癌8。其中的一些因素，如EGF被用作化学引诱物中浸润室9直接来源。因此，它很可能是这些代表了血清肿瘤直接侵犯的主要组成部分。该协议提出了一种简单的，但显著，修改现有的体外侵袭测定法，其允许研究者评估在介导癌细胞的侵袭性潜力激素，生长因子和细胞因子的参与。但是，在测定的目的是提供一个答案的研究者以过程是否将是有效的对他们的研究在分析的早期步骤，以免使用宝贵的时间而r物资跟不上，如果认为没有必要。此方法使用的CS-FBS和依赖于研究者酌情决定哪个分子追求铅候选潜在介导癌细胞侵袭。从这些分析的结果应该被证明在确定其中血清组分充当被研究的化学引诱物或抑制剂对特定细胞系或突变体是有用的。此外，这种方法可以帮助研究者确定主要的信号通路或者促进或抑制癌细胞侵袭;从而引导未来的药物设计。
Protocol
Representative Results
Discussion
肿瘤转移是一个多步骤的过程。细胞必须通过基底膜断裂，intravasate成要么淋巴系统或血液微血管，它们被运到远处位点。肿瘤细胞然后外渗和移成macrometastasis 12。通过上皮间质转化（EMT），肿瘤侵袭和转移的进展已增强了类固醇激素13,14，生长因子15-18和细胞因子19-21。这些分子是如此关键，解决肿瘤进展的信号通路，即化验的发展，以解决他们在肿瘤侵入的潜在…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding sources from D’Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.
Materials
| Item | Vendor | Catalog # | Comments/Description |
| BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates) |
Corning | 354578 | polyethylene teraphthalate (PET) membranes |
| Collagen I, rat tail | Corning | 354236 | Source = rat tail tendon, purity = 90% |
| Fixative; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin |
| Fetal bovine Serum | Life Technologies | 16000 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 12676 | Designated as CS-FBS |
| Fetal bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | Designated as FBS |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | Designated as CS-FBS |
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