从子宫切除标本中建立原代子宫内膜基质细胞培养体系是一种有价值的生物学技术，也是开展多种研究目标之前的关键步骤。本文中，我们描述了两种用于从人患者手术切除的子宫内膜组织中建立基质细胞培养的方法。
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方法文章
从子宫切除标本中建立原代人子宫内膜基质细胞的两种方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
人们已投入大量努力来建立体外（in vitro）细胞培养系统，这些系统旨在模拟多种体内（in vivo）过程。来源于人子宫内膜样本的细胞培养系统也不例外，其应用范围涵盖正常的周期性生理过程，到诸如妇科癌症、感染性疾病和生殖功能障碍等子宫内膜病理状态。本文提供了两种从手术切除的子宫内膜子宫切除标本中建立原代子宫内膜基质细胞的方法。第一种方法称为“刮取法”，通过手术刀或剃刀进行机械刮取；第二种方法称为“胰蛋白酶法”，利用胰蛋白酶的酶活性促进细胞分离和原代细胞的生长。我们通过数字图像和显微镜图像展示了每一步操作的详细方法，并提供了通过定量实时聚合酶链式反应（qPCR）和免疫荧光（IF）对子宫内膜基质细胞系进行鉴定的示例。
引言
人类子宫体由三层组成，即外膜（或浆膜）、肌层和内膜。区分这三层是建立内膜细胞系的重要步骤。外膜是子宫的最外层，由一层薄的浆液性细胞构成。肌层是子宫较厚的中层，由平滑肌细胞组成。内膜为子宫的内层，包含上皮细胞和间质细胞群体。
子宫内膜进一步分为基底层，其干细胞群体被认为大约每28天重新填充功能层 1人类子宫内膜的功能层会因循环激素的作用而发生显著的生化和形态学变化。这些激素来源于垂体和卵巢。
激素的协调产生与释放导致生殖周期的发生。生殖周期旨在使子宫内膜为潜在的胚胎着床做好准备。在人类中，生殖周期被称为“月经周期”，并分为三个阶段——增殖期、分泌期和月经期。增殖期涉及子宫内膜功能层的增殖，而分泌期则以功能层的成熟为特征。具体而言，细胞外结构的改变、分泌物的产生以及细胞分化提示可能发生着床。如果在分泌期末期之前未发生着床，子宫内膜功能层将在月经期脱落。关于月经的重要性及其触发功能层脱落的具体事件，目前仍在讨论之中。在人类中，有观点认为月经是分泌期中期一种特定分化事件的结果，该事件被称为“自发性蜕膜化”。 2在本论文中，我们提供了两种子宫内膜基质细胞分离方法的详细操作流程，并结合免疫荧光与数字图像技术，展示这些方法的有效性。此外，我们应用了一种常用 体外 自发性蜕膜化模型以验证子宫内膜基质细胞的分离。
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方案
本手稿所使用的子宫切除标本均根据大学机构审查委员会批准的伦理协议（编号：IRB-HSR #14424）收集。
1. 来自临床来源的样本采集
- 在开始之前，获取政府和机构的伦理指南及批准文件。
- 所有步骤均需在无菌条件下进行。
- 若样本无法立即进行培养，应将患者来源的组织保存在培养基（RPMI 或 DMEM/High Glucose）中，置于 50 ml 离心管内，4 °C 保存。样本在此状态下最长可保存 24 小时。
- 用 1X 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织样本三次，每次清洗后弃去上清液。
2. 使用刮取法制备原代细胞系
- 向组织中加入 4-10 ml 生长培养基（RPMI 或 DMEM/高葡萄糖，添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素），并加入 Fungizone（终浓度为 0.25 µg/ml），作用 30 分钟。
- 弃去生长培养基。
- 用 1X PBS 洗涤组织两次。
- 将组织置于 6 cm 细胞培养皿中，以区分肌层与内膜层 （参见图 2A-2C 以获取进一步说明）。分离出内膜组织。
- 使用手术刀或剃须刀片在 6 cm 细胞培养皿表面刮擦的同时将组织切成小块。这些刮痕有助于原代子宫内膜细....
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结果
如实验方案部分所强调的，在处理和制备人体组织时，务必遵守政府、机构及伦理准则。
本论文包含建立原代子宫内膜细胞培养所用的“刮取法”（图1A）和“胰酶消化法”（图1B）的一般操作流程示意图。这两种方法在实验方案部分（见第1.-3.步）中有详细描述。两种方法均可成功培养原代子宫内膜细胞。其中，“刮取法”的优势在于制备时间较短；然而，与“胰酶消化法”相比，观察到活细胞所需的时间通常要长2至4倍。
以下是来自组织采集的初始人体组织的数字图像。可通过各层组织的粗细程度来区分子宫的各层结构，即肌层较厚且呈肌性，而子宫内膜较薄且质地较柔软。我们用白色高亮显示了厚实的平滑肌层（肌层），并用黑色轮廓标出了两个不同子宫切除样本中感兴趣的子宫内膜层（图2A和2B）。在图2C中，组织的摆放方向为肌层朝上，子宫内膜朝下。薄薄的浆膜层已.......
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讨论
其他研究团队已描述并改进了子宫内膜基质细胞培养的制备方法，其中大多数方法采用胶原酶 4,12,13,15-18。在本文中，我们提供了两种简化的原代子宫内膜基质细胞培养方法及其相关证据，本实验室出于经济性以及胰蛋白酶和/或剃刀片易于获取的考虑，正在使用这两种方法。
在比较我们的两种方法时，两种方法均能成功建立可存活的原代培养细胞。我们更倾向于使用胰蛋白酶法，因为该方法通常产量更高，且所需样本量较小。然而，如果准备时间有限，刮取法仅需30分钟，而使用胰蛋白酶法接种细胞则需要一个半小时以上。
值得注意的是，本研究采用子宫切除术样本而非子宫内膜活检样本进行方法学展示。子宫内膜活检侵入性较小，通常获得的标本量较少。然而，本文所述方法（尤其是胰蛋白酶法）应同样适用于子宫内膜活检样本并获得培养物。
原代子宫内膜基质细胞具有多种应用价值。比较人类与其他哺乳动物的子宫内膜基质细胞培养，可能为长期存在争议的问题提供线索：为何人类会发生月经。此外，尚有其他尚未深.......
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披露
作者无任何披露事项。
致谢
感谢 Thao Dang 博士及其实验室成员提供成像和显微镜设备的使用支持。同时感谢弗吉尼亚大学生物样本库与组织研究设施（BTRF）核心、Jeff Harper 以及该校住院医师为我们提供子宫组织样本。感谢 Karol Szlachta 在示意图概览方面的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25 胰蛋白酶或 0.05% 胰蛋白酶 | Hyclone | SH3023602 或 SH30004202 | |
| 1.7 微型离心管 | Genesee Scientific | 22-272A | |
| 1 µl、20 µl、200 ml 和 1,000 µl 移液器 | Genesee Scientific | 24-401、24-402、24-412、24-430 | |
| 15 ml 锥形管 | Hyclone | 339650 | |
| 50 ml 锥形管 | Hyclone | 339652 | |
| 6 cm 细胞培养皿 | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 孔板室 | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| 乙酸盐 | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV 逆转录酶/缓冲液 | Bio Labs | M077L | |
| 牛血清白蛋白 (BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| 缓冲锌福尔马林 | Thermo | 59201ZF | |
| 活性炭处理胎牛血清 (FBS) | Fisher | NC9019735 | |
| 氯仿 | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| 盖玻片 | Fisher Brand | 12-544D | |
| 环磷酸腺苷 (cAMP) | Sigma | B7880 | |
| DMEM/高葡萄糖 | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| 驴抗山羊-TRITC | Santa Cruz | SC-3855 | |
| 驴血清 | Jackson’s lab | 017-000-002 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | Epitomics | 1702-1 | |
| 乙醇 | Fisher Scientific | BP2818-1 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| 两性霉素B（Fungizone） | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH 探针 | Life Technologies | HS99999905 | |
| 糖原 | 5Prime | 2301440 | |
| 山羊抗小鼠-FITC | Jackson’s Lab | 115-096-003 | |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| 卡那霉素 | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| 醋酸甲羟孕酮 (MPA) | Sigma | M1629 | |
| 甲醇 (MeOH) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| 封片剂（含DAPI） | Vector Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA 寡核苷酸 | Invitrogen | ||
| 15 号刮铲 | BD | 371615 | |
| 广谱细胞角蛋白 小鼠单克隆抗体 | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS（磷酸盐缓冲液） | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺溶液 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML 山羊多克隆抗体 | Santa Cruz | SC-9862 | |
| 引物(s) | Eurofins | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI（无酚） | Gibco | 11835 | |
| Sybr Green | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| Taqman | Thermo | AB-4138 | |
| Trizol | Life Technologies | 15596018 | |
| 波形蛋白抗体 | Epitomics | 4211-1 |
参考文献
- Heller, D. in The endometrium: a clinicopathologic approach. Heller, D. , 56-75 (1994).
- Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal inva....
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重印与许可
