A cultura in vitro modelo celular para Toxic Chemical Testing Inhaled
Summary
Este protocolo destina-se a demonstrar o método de exposição de culturas de células a produtos químicos tóxicos inalados. Exposição de diferenciado interface ar-líquido (LPA) culturas de células epiteliais das vias aéreas oferece um modelo único de exposição das vias aéreas de gases tóxicos como o cloro. Nesse artigo, descrevem efeito de exposição ao cloro em culturas de interface ar-líquido de células epiteliais e de cultura submersa de cardiomiócitos. Em sistemas de exposição in vitro permitem estudos sobre os mecanismos importantes para avaliar as vias que poderia, então, ser utilizados para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.
Abstract
As culturas celulares são indispensáveis para desenvolver e estudar a eficácia de agentes terapêuticos, antes da sua utilização em modelos animais. Nós temos a capacidade única de modelar células do epitélio das vias aéreas humana e do músculo cardíaco bem diferenciadas. Esta poderia ser uma ferramenta de valor inestimável para estudar os efeitos deletérios de produtos químicos tóxicos inalados, tais como o cloro, que normalmente podem interagir com as superfícies das células, e formam vários subprodutos quando reagem com água, e limitar os seus efeitos em culturas submersas. Nosso modelo utilizando culturas de células epiteliais das vias aéreas o bem diferenciadas em interface ar-liqiuid contorna essa limitação, bem como fornece uma oportunidade para avaliar mecanismos críticos de toxicidade de potenciais químicos inalados venenosas. Descrevemos aprimorada perda da integridade da membrana, liberação caspase e morte sobre química inalado tóxico, como a exposição de cloro. Neste artigo, propomos métodos para modelar exposição de cloro no coração de mamíferos e das vias aéreas epitelial cvaras de cultura e testes simples para avaliar seu efeito sobre esses tipos de células.
Introduction
A exposição a produtos químicos tóxicos inalados (tiques) / gases, tais como o cloro (Cl 2) continua a ser um problema de saúde em curso em exposição acidental, assim como no seu uso potencial como um agente de ameaça química. Embora os pulmões são o principal alvo, órgãos como o coração eo cérebro também são afetados 1-3. Modelos in vivo são geralmente utilizados para testes de toxicidade de TICs, mas em ensaios in vitro para avaliação de toxicidade são mais simples, mais rápido e mais rentável. In vitro modelos também permitem extensa investigação de interações célula-agente que podem ser difíceis de avaliar in vivo. Tais sistemas de exposição in vitro são raros e, além disso, em alguns dos modelos convencionais, onde os agentes tóxicos são adicionadas ao meio de cultura no qual as células são submergidas, as propriedades dos agentes pode mudar devido a interacções e ligação de componentes do meio. Em tais cenários sistemas de cultura de células, como a interface ar-líquido (ALI) culturas de células primárias das vias respiratórias humanas epiteliais, aqui propostas, que podem ser diretamente expostos a agentes gasosos pode ser promissor.
As células epiteliais que revestem as vias aéreas são as primeiras linhas de defesa contra substâncias químicas tóxicas inaladas. O epitélio das vias respiratórias humanas forma uma barreira física entre o lúmen e as células subjacentes no pulmão e participa na resposta do pulmão. Ela produz um número de citocinas e outros agentes pro-e anti-inflamatórias bem como segrega líquido superfície muco / vias aéreas (ASL) que cobre o epitélio. Uma das limitações em convencional submerso em sistemas de cultura in vitro é também que o ASL e muco que cobre a superfície epitelial é removido ou diluído. Isto não reflecte o estado fisiológico das células epiteliais pulmonares, que são expostas ao ar. Assim, um ideal sistema in vitro para testes de toxicidade TIC deve replicar esta arquitetura. Há um grande interesse no desenvolvimento rápido de triagem métodos que predizem em toxicidade in vivo. As células epiteliais cultivadas no ALI diferenciar e têm estruturas e funções bem diferenciadas em comparação com células cultivadas submersas e servir um modelo superior das vias respiratórias.
Neste estudo, descrevemos o uso de cultura de ar-líquido interface de vias respiratórias humanas (traqueobrônquicos) células epiteliais para testar a toxicidade do gás inalado venenoso e compará-lo com uma cultura de células submersa de cardiomiócitos, portanto, estudar um outro alvo importante de toxicidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
O tipo mais comum de exposição tóxica aguda ocorre quando se respira um produto químico venenoso para os pulmões. Estes produtos químicos também podem ser tomadas rapidamente na corrente sanguínea e pode afetar outros órgãos, como o cérebro eo coração. Inalação de toxicidade de vários agentes que utilizam modelos animais são amplamente estudado e relatado, no entanto, os mecanismos são menos bem compreendidas. Este é um grande obstáculo no desenvolvimento de terapias eficazes. Ausência de em</em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa é apoiada pelo Programa CounterACT, National Institutes of Health (NIH), Gabinete do Diretor, e do Instituto Nacional de Ciências de Saúde Ambiental (NIEHS) Número Grant U54 ES015678 (CWW). SA também é suportado pelo Hospital Infantil Escola Colorado / Colorado de Minas Collaboration Award Pilot # G0100394 e Hospital Infantil de Colorado Research Institue Award Pilot # G0100471.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | |
| Rats | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 kit | Promega | G8091 | |
| Epithelial voltohmmeter and chopstick electrode | World Precision Instruments | EVOM and STX2 | |
| Snapwell inserts | Corning | 07-200-708 | |
| 70 micron nylon cell strainer | Corning | #352360 | |
| Polysulfone biocontainment chambers | BCU, Allentown Cage Equipment | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin antibody | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 antibody | Affinity Bioreagents, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 antibody | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa-488-conjugated secondary antibody | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Carnitine | Sigma-Aldrich | C0283 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C6257 | |
| Krebs Ringer Buffer | Sigma-Aldrich | K4002 | |
| Protease | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| Lactated Ringer solution | Abott Laboratories | 7953 | |
| Donkey serum | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE gels | Bio-Rad | 456-1083 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Peroxidase detection kit | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Mounting media, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | Sigma-Aldrich | M8028 | |
| Laminin | BD biosciences | 354259 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
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